CRISPR-Cas9技术可用于体内编辑，攻克ATTR淀粉样变性出现治疗转机

近日，一项临床试验的初步结果显示，CRISPR-Cas9基因编辑可以直接部署到患者体内以治疗疾病。作为目前最精确、最通用的基因组编辑技术，CRISPR-Cas9仍然在引领着医学和科学革命。CRISPR-Cas9的全称为“Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats and CRISPR-related protein 9”。CRISPR-Cas9系统有两个重要的分子，可以引起 DNA 的变化。第一个就是 Cas9，它充当“分子剪刀手”的角色，在基因组中的某个位置切割两条DNA链，以便能够添加或删除部分DNA。第二个重要分子则是向导RNA (gRNA)，它由在较长的RNA结构中所发现的约20个碱基长的RNA序列组成。预先设计的RNA序列将Cas9引导到基因组的准确部分，而较长的RNA则与DNA结合，确保Cas9能够正确切割基因组。

gRNA的目的是结合并找到目标的DNA序列。它具有与基因组特定DNA序列互补的 RNA 碱基，但它结合的仅仅是目标序列，而并不会干扰基因组的其他部分，因此Cas9将跟随gRNA到达目标DNA序列的位置以切割DNA链。在此期间，细胞会尝试修复DNA中的损伤。

CRISPR-Cas9目前已经在一些人类健康场景实现了应用。2013年，研究人员曾使用CRISPR-Cas9成功从艾滋病携带者的基因组中去除了HIV DNA，并针对HIV-1 LTR抑制了Jurkat细胞中HIV-1基因的表达，该研究表明CRISPR-Cas9可能具有治疗 HIV 的潜力。

近年来，多家制药公司投资开发基于CRISPR的药物以治疗失明、血液病、心脏病等疾病。而在ATTR淀粉样变性领域，最近一种由美国马萨诸塞州的基因编辑公司Intellia Therapeutics和纽约的生物制药公司Regeneron联合开发的新疗法NTLA-2001为人类健康开启了另一扇令人惊喜的大门：CRISPR-Cas9可被直接用于在体内进行编辑基因。

研究首次表明，如果将CRISPR-Cas9成分（在这一案例中针对主要在肝脏中制造的蛋白质）注入血液中，这一行为是安全且有效的。研究人员为六名患有罕见且致命的转甲状腺素蛋白淀粉样变性病的患者安排了基因编辑疗法的单一治疗。治疗结果显示，所有人与疾病相关的畸形蛋白质水平都实现了下降，而在两种测试剂量中，接受较高剂量注射的患者的转甲状腺素蛋白水平则平均下降了87%。

转甲状腺素蛋白淀粉样变性，也称为ATTR淀粉样变性，是一种进行性致命疾病。其特征是错误折叠的转甲状腺素蛋白(TTR)在神经和心脏等关键组织中逐渐积累。来自后天的ATTR淀粉样变性被称为野生型ATTR淀粉样变性，这种形式的 ATTR 淀粉样变性近来被广泛认为是造成心肌病和心力衰竭的原因。在极少数情况下，ATTR淀粉样变性具有遗传性，称为变异型或遗传型ATTR(hATTR)淀粉样变性，hATTR淀粉样变性可由一百多种不同的TTR致病突变触发。

全球约有五万人患有遗传型ATTR淀粉样变性。它的临床症状一般表现为常染色体显性遗传模式，以淀粉样多发性神经病或心肌病为主，大多数患者同时具有两者情况。心肌病的症状出现后，这种进行性变性最终会导致患者在确诊后的2-6年内死亡，没有出现心肌病的患者会在症状出现后的4-17 年内死亡。

转甲状腺素蛋白淀粉样变性已成为旨在禁用致病基因的新医疗技术的主要目标。目前，ATTR淀粉样变性的治疗策略依赖于通过稳定TTR的四聚体形式（使用二氟尼柳或Tafamidis）或通过降解TTR信使RNA抑制TTR蛋白质合成（使用Inotersen或Patisiran）来减少正在进行的淀粉样蛋白形成(mRNA)。这种治疗方式可以缓解症状并延长患者生存期，但受限于需要长期供药维持。在使用Patisiran的情况下，长期治疗会导致患者持续暴露于糖皮质激素和抗组胺药等术前用药。Inotersen则会产生严重的副作用，包括肾小球肾炎和血小板计数的减少。

如何增强且持续增强TTR的敲减，成为了治疗策略的突破点。基于mRNA靶向基因沉寂的其中一个替代方案，可能会是使用成簇的规则间隔短回文重复序列和相关的CRISPR-Cas9系统来实现体内基因编辑。作为一种单基因疾病，ATTR淀粉样变性是CRISPR-Cas9介导的体内基因编辑应用的理想靶点。TTR在甲状腺素和维生素A转运中有限且特定的正常功能，意味着基因敲减的副作用有限。此外，循环TTR几乎完全(>99%)在肝脏内产生，已建立的靶向系统如脂质纳米颗粒是完全可用的。

NTLA-2001是一种基于CRISPR-Cas9的体内基因编辑新疗法，通过静脉输注给药来编辑肝细胞中的TTR，旨在通过降低血清中TTR 的浓度来治疗ATTR 淀粉样变性。在小鼠模型和非人类灵长类动物模型中，单次给药导致血清TTR蛋白持续降低了95%以上，因此这一疗法也许会提供比目前可用的所有疗法都更有效的TTR抑制作用。

图表1：NTLA-2001 的作用机制

(A)显示了NTLA-2001 的主要成分。NTLA-2001的载体系统是脂质纳米颗粒 (LNP)。LNP基于专有的可电离脂质，结合磷脂、聚乙二醇化脂质（聚乙二醇的分子量，2000 Da）和胆固醇，在水性缓冲液中配制用于静脉给药。NTLA-2001 的活性成分是一种人类优化的信使 RNA (mRNA) 分子，编码化脓性链球菌(Spy) Cas9 蛋白（一个大约4400个核苷酸的序列，分子量约为1.5 MDa）和一个单一的引导 RNA (sgRNA) 分子（分子量约为 35 kDa），特异于编码转甲状腺素蛋白(TTR)的人类基因。这些成分构成了用于给药的 LNP 货物。静脉注射NTLA-2001并进入循环后，LNP被载脂蛋白E(ApoE)调理并通过体循环直接转运到肝脏，在那里优先分布。

(B)显示了NTLA-2001 LNP如何转运到肝脏内肝窦毛细血管中。与其他临床批准的 LNP一样，NTLA-2001预计会被肝细胞表面表达的低密度脂蛋白(LDL)受体吸收，然后进行内吞作用和内体形成。在LNP分解和内体膜破裂后，活性成分（TTR特异性sgRNA和编码Cas9的mRNA）被释放到细胞质中。Cas9 mRNA分子通过天然核糖体过程进行翻译，产生Cas9核酸内切酶。TTR与Cas9特异性相互作用因组内切酶，从而形成聚集的定期间隔开短回文重复序列(CRISPR)–Cas9核糖核蛋白复合体。

(C)显示Cas9核糖核蛋白复合物是针对核输入和进入细胞核的。它能够在TTR的非互补 DNA链上识别前间区序列邻近基序（PAM）。CRISPR-Cas9复合物解开螺旋并进入靶基因，在Cas9经历了一系列构象变化和核酸酶域激活（HNH 和 RuvC 域）后，DNA切割精确靶向TTR序列，由sgRNA互补序列定义。内源性DNA修复机制连接切割的末端可能会引入碱基的插入或缺失(indels)。由于错义或无义突变减少了全长mRNA的数量，插入缺失的产生可能导致功能性靶基因mRNA水平降低，最终导致靶蛋白水平降低。导致目标蛋白（此处为TTR）产生障碍的插入或缺失被称为敲除突变。

在进行了体外和体内临床前研究后，研究人员评估了单次递增剂量 NTLA-2001 的安全性和药效学效应，为六名遗传性ATTR淀粉样变性伴多发性神经病患者设置了0.1mg/kg和0.3mg/kg两个初始剂量组，每组各有三名患者。

图表2：患者输注NTLA-2001后血清 TTR 蛋白浓度相对基线降低

(A)显示接受NTLA-2001剂量0.1mg/kg的患者组中总循环血清 TTR 蛋白相对于基线的百分比变化。根据生物标志物方法验证的监管指南，通过经过验证的酶联免疫吸附测定方法对 TTR 蛋白进行定量。血清样品测量一次，每个样品一式两份进行测试。对于接受 0.1mg/kg剂量的组中的每位患者，数据显示在给药后第7、14 和28天的给药前基线值（来自三个采样时间点的平均浓度）的百分比降低。(B)显示接受NTLA-2001剂量0.3mg/kg的患者组中总循环血清 TTR 蛋白浓度的百分比变化。方法和分析与(A)中描述的相同。(C)显示了两个剂量组在第 28 天总循环血清 TTR 蛋白相对于基线的平均（每组三个）百分比减少。? 条形表示标准偏差。

目前，研究人员正在将焦急地等待更多参与者的长期数据，但目前的结果足以点燃医学突破的希望。CRISPR-Cas9有朝一日不仅能够帮助治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性，也许还能够帮助人类治疗其他疾病。

将CRISPR-Cas9组件输送到身体各个部位的技术正在迅速发展。未来，基因编辑将得到更加广泛的应用。Intellia正在尝试开发一种治疗镰状细胞性贫血的方法，这种方法将避免目前正在进行的基因编辑试验中危险而艰巨的骨髓移植手段。

参考文献：

Gillmore JD, Gane E, Taubel J, Kao J, Fontana M, Maitland ML, et al. CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis. NEJM 2021;6:26

Marcoux J, Mangione PP, Porcari R, et al. A novel mechano-enzymatic cleavage mechanism underlies transthyretin amyloidogenesis. EMBO Mol Med 2015;7:1337-1349.

Gertz MA, Benson MD, Dyck PJ, et al. Diagnosis, prognosis, and therapy of transthyretin amyloidosis. J Am Coll Cardiol 2015;66:2451-2466.

Ando Y, Coelho T, Berk JL, et al. Guideline of transthyretin-related hereditary amyloidosis for clinicians. Orphanet J Rare Dis 2013;8:31-31.

京东健康互联网医院医学中心 

刘雨洁，本科毕业于南开大学，纽约大学研究生在读，关注神经科学、生物制药、基因技术、细胞技术等领域的前沿技术成果。