关于射精次数和射精后是否会因消耗殆尽而导致阳痿的问题，可以从以下几个方面进行解答：

一、射精次数

射精次数并没有一个固定的标准，它受到多种因素的影响，包括年龄、身体状况、性需求、性生活频率等。

青壮年：由于精力旺盛，每周2-3次，甚至4-5次的射精频率都是正常的。

中老年人：由于精力不足，性需求一般每周1-2次是正常的。

性需求较低的人：可能一个月一次或几个月一次都是正常的。

因此，射精次数应根据个人的实际情况和身体状况来判断，避免过度频繁或过度抑制。

二、射精后是否会因消耗殆尽而导致阳痿

射精多或频繁射精确实可能会增加阳痿发生的风险，但并非绝对。阳痿的发生往往是多种因素综合作用的结果，包括生理因素、心理因素、疾病因素等。

生理因素：频繁过度射精会使性器官反复、持续处于充血状态，容易引发前列腺炎等疾病，这些炎症可能影响阴茎勃起功能。同时，过度射精会导致身体和精神的疲惫，体力和精力消耗过大，长期处于这种状态下，会使男性在性生活中出现勃起困难或勃起不坚等阳痿表现。

心理因素：频繁射精可能使男性产生焦虑、紧张、自责等不良情绪，这些负面心理状态可能进一步加重性功能障碍，形成恶性循环。

中医角度：过度射精还可能导致身体肾气亏损，中医认为肾与性功能密切相关，肾气不足也可能影响阴茎的正常勃起功能。

然而，需要注意的是，射精多或频繁射精并不一定会导致阳痿。每个人的身体状况和性需求都是不同的，因此应根据自己的实际情况来判断射精的频率是否合适。

三、建议

保持健康适度的性生活频率：避免过度频繁或过度抑制的射精行为，根据自己的身体状况和性需求来合理安排性生活。

注意身体健康：保持良好的生活习惯和饮食习惯，避免过度劳累和熬夜等不良行为对身体的损害。

及时就医：如果出现性功能方面的异常或不适，应及时就医进行全面的评估和诊断，并采取合适的治疗措施。

总之，射精次数应根据个人实际情况来判断，避免过度频繁或过度抑制。同时，保持健康的生活方式和适度的性生活频率对于维护良好的性功能和身体健康至关重要。

如果你出现这些症状，说明你的肾精快用完了。

#健康科普在 

观叶天士奇络治法和用药，在深度和广度上较之前人都有很大程度的发挥和创新。叶天士善用古方，然师古而不泥古，有时只取其法，有时但求其意。其在用药方面受《黄帝内经》及张仲景、孙思邈、许叔微、张景岳等人启发，取多家之长，如七疝之气实者多从子和;淋浊实证取朱南阳“以浊泄浊”之法，参用濒湖疏泄厥阴、温通精隧之意;而用虫类搜剔法则效法于仲景之鳖甲煎丸。

 
奇络虚证之治，重视柔润通补

 

奇络气血由十二经气血满溢而充盈，脏腑功能盛衰是经络气血盛衰之源泉，故病在奇络，而治在脏腑。八脉多起于下焦，隶属于肝肾，肝肾亏虚则八脉充养乏源，是奇络虚证之主因，尤以肝肾阴血亏损为主。经络气血又受后天脾胃水谷精微充养，故叶天士常从治肝肾脾胃以治奇络病。但奇络病属经络病范畴，与脏腑病有别。虚者补之固为大法，然“补”非腻补所宜，滋腻之品有碍气机运化，不能通入奇经，须用通补之品。

 

 

“通”者又须是柔润之剂，即非燥烈刚性之类如桂、附者，恐其更伤阴液。由阴损及阳，以阴虚为主，阳气浮越者，治从阴引阳;以阳虚为主，精无以生者，治从阳引阴。总以阳宜通、阴宜固为原则，以通阳摄阴、温补通纳为大法。

 
凡内损精血形气，奇脉失护，当予味厚质静或血肉有情之品填实精髓。肝肾阴亏，肝阳易于上越，法当益阴潜阳，佐以凉肝坚阴，药用介类潜之，酸味收之，厚味填之，咸味下引，苦味坚阴。遗精滑泄，以补肾固精、升固八脉之气为要，若涩剂乏效，必以滑药引导，所谓滑涩兼施。男子淋浊，亦如女子崩漏带下，最易损人津液，而致奇络亏虚，当调理任督冲带，不宜宣利清解，徒伤正气阴液。男子内结七疝，属任脉为病，若属阴虚气坠或精血内损所致精空气结，则非张子和辛热疏泄通络法所宜，而需用精血有情之品涵养生气，以及辛润温补通络法治之。

 
女子经带胎产蓐劳所致诸病，都是阴液气血亏损，与冲任督带更是息息相关。又因女子以肝为先天，冲脉隶于阳明，故月经失调，病在冲任，治重调肝，又需顾及脾胃。产后病主以温养气血，产后久损不复延为蓐劳，为真阴亏损，阴虚生热，治应温补气血充养任督，兼除虚热。暴崩暴漏宜温宜补，因病在下焦，须以固摄奇经之药，常用方如震灵丹;久崩久漏宜清宜通，因血去阴耗耳，当以养阴清热、通摄兼施。

 
强调久病入络，治之需分虚实

 

初病在经，久病入络，经主气，络主血，络病须治血，然血因气滞，气随血结，不通则痛，以辛、香、润、温之品疏理气机，通和血脉是大法。治络先分虚实：络虚邪乘，血不与邪气和则生胀痛，非偏寒偏热可治，当予补养气血，充养脉络;瘀浊阻络则为络实证，常法有辛润通络、辛香通络、辛温通络、虫类通络等。但因久病所致者，如女子经闭、男子瘕疝等必多虚实夹杂，破气开结，虫类搜剔多耗气伤正，可于补剂中略加一、二以扶正祛邪，宜制丸轻剂缓图。

 

 

重视脾胃功能，讲究通补治法

 

叶氏强调阳明是“中流砥柱”，阳明虚而中乏“坐镇之真气”，则有肝风、冲脉上逆莫制之机。冲脉隶于阳明，阳明空虚，血气无以汇聚冲脉则经少经闭，阳明失阖则漏下不止，故有治肝不应，则从阳明。

 
脾胃为气血生化之源，用药投剂须先顾及胃口，如食少便溏，则非滋补肝肾之治所宜，务先使胃纳有加，再图攻补。脾阴宜固，胃腑宜通;脾升则健，胃降则和。故补阳明胃腑必以通降之品，如茯苓、半夏;补脾用人参、山药、莲肉等。

 

重视体质因素

 

少年精髓不充，形质羸弱，需填精固髓;凡中年以后，或久病体虚者，治法以润补为主;形瘦色苍者不宜辛热温补;女子首重调经，故有治脾胃不应者，治肝调经而病自去;室女不在温补之例;产后体虚必以温养气血为主，忌用燥热伤阴。情志为病者，还需以调适情志为根本，非药物能除根等。

六味地黄丸是滋补肾阴的名方，由熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻六味药组成，其中又以熟地黄作为君药，用量最大，故名为六味地黄丸。

那么我们再来看备孕的人到底能不能吃六味地黄丸。

首先，从中药学的角度来看，这六味药都是常用药，药性温和，没有毒性，从儿童至老年人，只要对症，皆可服之。

其次，从功效来分析，六味地黄丸是滋补肾阴的名方，方中重用熟地黄，滋阴补肾，填精益髓，为君药。山萸肉补养肝肾，并能涩精；山药补益脾阴，亦能固精，共为臣药。三药相配，滋养肝脾肾，称为“三补”。

同时配伍丹皮、泽泻、茯苓三味药，使补药补而不腻，配伍精当。能治疗肾阴亏损引起的头晕耳鸣，腰膝酸软，骨蒸潮热，盗汗遗精，消渴等病症。

虽然我们已经知道了六味地黄丸的功效，明白了这个药的安全性，这是否就意味着任何人都能吃呢？

答案是否定的。六味地黄丸有明确的适应症，那就是肾阴亏虚。如果是肾阳虚的人吃了六味地黄丸，不但起不到治病的作用，还可能使阳虚的病情加重；除了肾阳虚的人以外，痰湿、湿热体质的人群也是六味地黄丸的禁忌人群。

中医学强调 “有是证用是方”，同时也不主张滥服药物，药补不如食补。

第一种：湿热下注，阻滞精室

主要症状是：夫妻性交时无胀痛精液射出，且强阳不倒，睾丸部位及少腹部胀痛，口干不 欲饮水，尿黄而浑浊舌尖红，苔黄腻。

第二种：肝郁血瘀，疏泄失职

主要症状是：性交后不射精，阴茎有憋胀感，平时沉默寡言，时常长吁短叹，闷闷不乐，头昏脑胀，胸协满闷，舌边紫暗，苔薄白，脉弦滑。

第三种：肾精亏损，阴虚火旺

主要症状是：夫妻性交时不射精，平时头昏目眩，神疲乏力，失眠多梦，伴有梦遗，心悸不适，五心烦热，小便黄浊，舌质红，舌苔少，脉细数。

第四种：脾肾阳虚，命门火衰

主要症状有：性欲不高，有时举而不坚，偶有夫妻生活也不射精，偶有梦遗，面色泛白，平时畏寒怕冷，神疲乏力，腰膝酸软，耳鸣，容易出虚汗，大便不成型，舌质淡，舌苔薄白，脉沉细。

 

冻卵，受到了越来越多的关注。但你对冻卵女性了解有多少？她们年龄多大？冻卵后她们又如何使用的？通过1篇荟萃分析我们来一起揭秘。

一、研究方法

研究人员按照系统综述和荟萃分析的首选报告项目（PRISMA）建议进行了系统综述。他们搜索了 PubMed、Scopus 和 Web of Science 从建库到 2021 年 1 月的文献，对发表日期没有限制。纳入的研究需为英文，且研究了计划性冻卵的使用者或潜在使用者的特征、最初信息来源以及卵子处置情况。提取的数据通过主题分析进行分析，纳入研究的方法学质量使用 QualSyst 标准进行评估。

二、研究结果

1. 研究筛选情况
   • 最初检索到 1074 条记录，其中 29 项研究符合纳入标准，包括 12 项定性研究和 17 项定量研究。调查的回复率在 38% - 85% 之间。
2. 女性特征
   • 计划性冻卵的使用者或潜在使用者大多为单身、受过高等教育、有工作，平均年龄为 37 岁。
3. 信息来源
   • 媒体和朋友是计划性冻卵最初知识的最常见来源，而健康专业人员则是较不常见的来源。
4. 卵子使用情况
   • 大多数计划性冻卵者没有尝试使用冷冻卵子怀孕，但她们并不后悔进行了该过程。

三、讨论与启示

1. 人口特征与卵子使用
   • 计划性冻卵的大多数使用者或潜在使用者具有特定的人口统计学特征，并且最终大多没有使用她们冷冻保存的卵子。这可能是由于多种原因，比如在冻卵后的生活中，她们的生育计划发生了改变，或者虽然有生育的想法但尚未尝试使用冷冻卵子。
2. 卵子处置的选择
   • 对于未使用的卵子，存在多种处置方式。可以选择丢弃，这可能是因为女性认为自己不再需要这些卵子，或者缺乏合适的使用途径。也可以选择捐赠给其他女性，为那些有生育困难的女性提供帮助。此外，还可以捐赠给研究机构，用于相关的科学研究，以推动生育医学的发展。
3. 对健康专业人员的指导意义
   • 了解计划性冻卵潜在使用者的主要特征，健康专业人员可以更加主动地宣传正确的冻卵知识，包括冻卵的风险、成功率以及后续可能面临的问题等。同时，在咨询过程中，也可以根据女性的年龄、婚姻状况和生育计划等因素，提供更加个性化的建议，帮助她们做出更有效的决策。

参考来源：Giannopapa M, Sakellaridi A, Pana A, Velonaki VS. Women Electing Oocyte Cryopreservation: Characteristics, Information Sources, and Oocyte Disposition: A Systematic Review. J Midwifery Womens Health. 2022 Mar;67(2):178-201. doi: 10.1111/jmwh.13332. Epub 2022 Feb 13. PMID: 35156301.

原始卵泡位于卵巢皮质中，处于静止状态。其数量在出生时就已确定（每个卵巢大约 60 万到 100 万个），并在儿童期和整个生育期持续逐渐减少，因为原始卵泡会被募集并离开静止状态。

大多数原始卵泡在初次募集后发生闭锁，无法达到窦状卵泡阶段，只有少数能继续生长直至排卵，在生育期大约排卵 450 次左右，只有极少数卵泡能发育成有受精能力的卵子。当原始卵泡几乎耗尽，只剩下大约 1000 个原始卵泡时，就会导致绝经。

随着女性生育观念的转变以及医学技术的飞速发展，冻卵技术作为一种生育力保存的手段，正逐渐走进大众的视野。这一技术为女性在面临生育挑战时提供了一种可能的解决方案，无论是因为职业发展、个人生活规划，还是由于疾病治疗等原因导致的生育延迟或生育风险增加。

一、冻卵技术的原理与方法

冻卵技术的核心原理是在极低的温度下保存卵子，使其代谢活动几乎停止，从而延长卵子的存活时间。目前主要有两种常见的冻卵方法：慢冻法和玻璃化冷冻法。

慢冻法是一种较为传统的方法，它通过逐步降低温度，让卵子在这个过程中逐渐适应低温环境。在这个过程中，会使用一些冷冻保护剂来减少冰晶的形成，因为冰晶可能会对卵子的结构造成损伤。具体来说，卵子首先在含有一定浓度冷冻保护剂的溶液中进行预处理，然后以相对缓慢的速度降温，经过多个阶段的温度调控，最终将卵子储存于液氮中，温度可达 -196°C。

玻璃化冷冻法则是一种更为先进的技术，它能够在更短的时间内实现卵子的冷冻。这种方法使用了更高浓度的冷冻保护剂，并且通过极快的冷却速度，使卵子在瞬间从液态转变为一种类似玻璃的固态，从而避免了冰晶的形成。玻璃化冷冻法在保护卵子的结构和功能方面具有一定的优势，因此近年来受到了越来越多的关注和应用。

二、冻卵技术的适用人群与临床应用

1. 癌症患者的生育力保存 对于许多癌症患者，尤其是年轻女性，化疗、放疗等治疗手段可能会对卵巢功能造成不可逆的损害，导致生育能力丧失。冻卵技术为这些患者提供了在接受治疗前保存生育能力的机会。例如，在一些血液系统癌症或生殖系统癌症的治疗中，医生会建议患者在开始治疗前考虑冻卵。通过采集卵子并进行冷冻保存，患者在治愈癌症后，如果有生育的意愿，就有可能使用这些冷冻的卵子尝试受孕。
2. 延迟生育的女性 随着社会的发展，越来越多的女性选择在事业有成之后再考虑生育问题。然而，女性的生育能力会随着年龄的增长而逐渐下降，尤其是在 35 岁之后，这种下降趋势更为明显。冻卵技术为这些希望延迟生育的女性提供了一种保障。她们可以在年轻、生育能力较强的时候将卵子冷冻保存，等到合适的时机再尝试受孕。

三、冻卵技术的临床效果与影响因素

1. 卵子的存活率和受精率 冻卵技术的临床效果受到多种因素的影响。从卵子的存活率和受精率来看，不同的研究报道结果有所差异。一般来说，玻璃化冷冻法在卵子存活率和受精率方面可能表现出一定的优势。一些研究显示，玻璃化冷冻法的卵子存活率可达 90% 以上，受精率也在 70% - 90% 左右；而慢冻法的卵子存活率在 50% - 70% 左右，受精率在 60% - 70% 左右。然而，这些数据并不是绝对的，实际的存活率和受精率还会受到卵子本身的质量、冷冻保护剂的使用、冷冻和解冻的操作过程等多种因素的影响。
2. 怀孕率和活产率 冻卵后的怀孕率和活产率也是衡量技术效果的重要指标。随着技术的不断发展，冻卵后的怀孕率和活产率也在逐步提高。例如，慢冻法的活产率从早期的较低水平逐渐上升，从 1996 - 2004 年的每移植 21.6% 提高到 20，02 - 2004 年的 32.4%；玻璃化冷冻法的活产率和持续怀孕率从 2004 年之前的 29.4% 提高到 2004 年之后的 39%。但需要注意的是，怀孕率和活产率还与女性的年龄、身体状况、受孕环境等多种因素密切相关。

冻卵技术作为一种新兴的生育力保存手段，为女性的生育选择提供了更多的可能性。然而，我们也应该清醒地认识到，这项技术仍然处于不断发展和完善的过程中，面临着诸多技术挑战和伦理法律问题。只有通过不断的研究和探索，才能使冻卵技术更好地服务于女性的生育健康，为更多女性实现生育梦想提供有力的支持。

参考文献：Cacciottola L, Donnez J, Dolmans MM. Ovarian tissue and oocyte cryopreservation prior to iatrogenic premature ovarian insufficiency. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2022 May;81:119-133. doi: 10.1016/j.bpobgyn.2021.09.010. Epub 2021 Nov 15. PMID: 34887172.

在当今社会，女性面临着多种可能影响生育能力的因素，如癌症治疗、延迟生育等。因此，生育力保存成为了一个重要的研究领域，而冻卵技术作为其中的一种方法，正逐渐受到关注。其目的在于为面临生育风险的女性提供一种保存生育能力的选择，以便在未来需要时能够实现生育梦想。

冻卵技术的原理

为了长期保存细胞的活性，需要将细胞置于极低的温度下，使其进入一种类似于 “暂停生命活动” 的状态。对于哺乳动物细胞来说，通常使用的储存温度是 -196°C（液氮的温度）。在这个温度下，水呈固态，生物反应停止，对冻存细胞的主要威胁被认为是背景辐射对 DNA 造成的损伤。

然而，冻卵过程中最关键的是要避免在温度变化过程中对卵子造成损伤。当水冷却到冰点以下时会形成冰晶，冰晶的体积比液态水大，会对细胞内的细胞器造成压力和剪切力，导致细胞受损。因此，避免冰晶形成是成功冻卵的首要目标。此外，随着水的冻结，溶质被排除在固体之外，会使剩余未冻结溶液的溶质浓度升高，对细胞内蛋白质产生毒性，避免这种溶液效应是第二个目标。在解冻过程中，如果升温缓慢，会有自由水解冻和再结晶的危险，而快速升温则可能导致细胞外渗透压突然下降，引起自由水快速流入细胞，造成细胞肿胀和损伤，即渗透压冲击，避免这种情况是第三个目标。

为了实现这些目标，所有成功的冻卵方法都使用了一种叫做冷冻保护剂的化学物质。冷冻保护剂分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂是小分子物质，能够穿透细胞膜，与水分子形成氢键，防止冰晶形成，并在一定浓度下可使水形成玻璃化状态（一种固态但不膨胀的状态）。常用的渗透性冷冻保护剂有丙二醇（PROH）等。非渗透性冷冻保护剂则留在细胞外，通过从细胞内吸取自由水来使细胞内空间脱水，从而增加渗透性冷冻保护剂在细胞内的浓度，进一步协助防止冰晶形成。在解冻过程中，非渗透性冷冻保护剂还可以防止因细胞内冷冻保护剂不能快速扩散出去而导致的渗透压冲击，常用的非渗透性冷冻保护剂有蔗糖等。

冻卵的方法

1. 慢冻法（Slow - Freeze）
   • 慢冻法在卵子仍处于代谢状态时使用较低的初始冷冻保护剂浓度，以降低毒性。冷冻保护剂通常在室温下添加，然后温度逐渐降低（约 2°C/min）到 -6°C 的播种温度。在这个温度下，通过用冰冷的器械触碰冻存容器的外部，引入一个小冰晶作为种子，诱导溶液中的冰晶形成。然后溶液在这个温度下保持一段时间（如 10 - 30 分钟）以达到平衡，之后温度再逐渐降低到 -32°C。在这个过程中，冰晶在细胞外介质中逐渐生长，冷冻保护剂浓度逐渐增加，特别是在细胞内空间，通过非渗透性冷冻保护剂进一步脱水。最后将冷冻容器投入液氮中。
   • 在解冻时，为了防止冰晶再结晶，需要快速升温，但要注意避免渗透性冷冻保护剂在细胞内高浓度引起的渗透压冲击，因此需要使用额外的非渗透性冷冻保护剂。随着渗透性冷冻保护剂逐渐从卵子中扩散出来，非渗透性冷冻保护剂的浓度逐渐降低，直到卵子被放回标准培养基中。
2. 快速冷冻法（Vitrification）
   • 快速冷冻法（玻璃化冷冻）在室温下向细胞中添加高浓度的渗透性冷冻保护剂，由于这种高浓度的冷冻保护剂毒性较大，卵子不能在这个温度下长时间停留。经过短暂的平衡后，卵子直接投入液氮中。为了进一步防止冰晶形成，使用极快的冷却速度。在解冻时，也需要极快的升温速度以防止冰晶再结晶。

冻卵技术的临床应用

1. 癌症患者的生育力保存
   • 对于新诊断出癌症且面临绝育治疗的女性来说，冻卵是一种保存生育能力的方法。化疗和放疗等癌症治疗方法可能会导致卵巢功能衰竭，而冻卵可以在治疗前进行。例如，卵巢皮质含有大量原始卵泡，可以通过腹腔镜采集卵巢皮质，然后进行冻存。或者也可以采集处于生发泡阶段的卵子进行冻存，尽管生发泡卵子的体外成熟技术还不太可靠。
   • 在癌症患者中使用冻卵技术也存在一些问题，如刺激卵泡和采集卵子所需的时间可能会延迟癌症治疗，而且对于患有全身性或播散性恶性肿瘤的患者，移植冻存的卵巢组织需要谨慎，因为可能存在残留的恶性细胞。
2. 延迟生育
   • 随着社会的发展，越来越多的女性选择延迟生育。由于年龄的增长会导致生育能力下降，冻卵为这些女性提供了一种在年轻时保存卵子的方法，以便在未来想要生育时使用。然而，目前对于冻卵技术在延迟生育方面的应用，还缺乏长期的数据，例如需要冻存多少卵子才能实现满意的怀孕率还不确定。
3. 伦理问题及其他应用
   • 冻卵技术为那些反对胚胎冷冻保存的夫妇提供了一种选择，也可以用于一些胚胎冷冻保存不合法的国家。此外，冻卵还可以用于卵子捐赠，通过冻存捐赠者的卵子，可以解决传统卵子捐赠中存在的一些问题，如捐赠者的可用性、成本、同步捐赠者和接受者的日程安排等。

冻卵技术的临床结果

1. 存活率和受精率
   • 不同的研究报道了不同的卵子存活率和受精率。例如，一些研究使用慢冻法报道的卵子存活率在 50% - 70% 左右，受精率 60% - 70% 左右；而使用玻璃化冷冻法报道的卵子存活率和受精率可能更高，如一些研究中卵子存活率可达 90% 以上，受精率也在 70% - 90% 左右。
2. 怀孕率和活产率
   • 从临床结果来看，冻卵后的怀孕率和活产率也在不断提高。慢冻法的活产率从 1996 - 2004 年的每移植 21.6% 提高到 2002 - 2004 年的 32.4%；玻璃化冷冻法的活产率和持续怀孕率从 2005 年之前的 29.4% 提高到 2005 年之后的 39%。同时，冻卵后的流产率也呈现出随着活产率提高而下降的趋势。

参考文献：Jain JK, Paulson RJ. Oocyte cryopreservation. Fertil Steril. 2006 Oct;86(4 Suppl):1037-46. doi: 10.1016/j.fertnstert.2006.07.1478. PMID: 17008147.

在人类辅助生殖领域，冷冻保存技术是一项非常重要的技术手段。它包括精子、胚胎和卵母细胞的冷冻保存。研究表明，精子和胚胎的冷冻保存已经成为常规操作，卵母细胞的冷冻保存也正逐渐在临床实践中得到更广泛的应用。

胚胎冷冻保存降低了新鲜胚胎移植的数量，提高了体外受精（IVF）周期的有效性。数据显示，同时进行新鲜胚胎和冷冻胚胎移植的女性，通过使用冷冻胚胎可获得额外 8% 的生育机会。卵母细胞冷冻保存相较于胚胎冷冻有更多优势，比如为因肿瘤治疗或慢性疾病面临生育力丧失风险的女性保存生育能力、用于卵子捐赠以及推迟生育等，还能避免胚胎冷冻所涉及的宗教和伦理道德问题。

冷冻保存技术的基本原理和方法

1. 传统缓慢降温法
   • 冷冻保护剂的作用
     • 在胚胎和卵母细胞的冷冻保存过程中，防止冰晶形成和有毒溶质浓度过高是关键，这两者是导致细胞死亡的主要原因。为了实现这一点，细胞悬浮的冷冻溶液中需要添加冷冻保护剂（CPA）。CPA 分为细胞内 / 膜渗透性（如丙二醇、二甲基亚砜、甘油、乙二醇等）和细胞外 / 膜非渗透性化合物（如蔗糖、海藻糖、葡萄糖、蛋白质、脂蛋白等）。渗透性 CPA 通过渗透梯度置换水分，部分占据细胞内水的位置，而非渗透性 CPA 则增加细胞外渗透压，在冷冻前支持细胞脱水，解冻后防止水分快速进入细胞。
   • 不同阶段的处理
     • 对于人类胚胎和卵母细胞，在缓慢降温前，通常会让其暴露于渗透性和非渗透性 CPA 的混合物中 10 分钟进行脱水。对于早期卵裂阶段的胚胎和卵母细胞，常用低浓度的丙二醇（1.5M）和蔗糖（0.1 - 0.25 - 0.5M），而囊胚阶段的胚胎则常用甘油。以最初成功的小鼠和牛胚胎冷冻保存协议为例，是将胚胎以 - 0.3°C - 0.5°C/min 的缓慢降温速率冷却到 - 80°C - 120°C，但这个过程很长（几个小时）。后来有了改进的方法，如将绵羊和牛胚胎以 0.3°C/min 的速率缓慢冷却到 - 30 - 35°C 后，再浸入液氮中，大大缩短了冷冻过程（1.0 - 1.5 小时）。人类胚胎一般是以 0.3°C/min 的低冷却速率冷却到约 - 30°C - 40°C，然后以 - 50°C/min 的速率增加冷却到 - 80°C - 150°C 后再浸入液氮中。在缓慢降温过程中，手动在 5 到 - 8°C 之间诱导冰晶成核（播种），缓慢冷却到 - 30°C - 40°C 后再快速冷却到 - 196°C 的胚胎 / 卵母细胞，需要在 25°C - 37°C 的温水中快速解冻，然后逐步去除 CPA 进行细胞再水化。
2. 玻璃化（超快速冷冻保存）法
   • 技术原理
     • 玻璃化是一种不同于缓慢降温的冷冻保存方法，它是在低温下通过极端提高粘度使溶液固化，避免冰晶在细胞内和细胞外空间形成。这是通过高浓度的 CPA（4 - 8mol/L）和极高（超快速）的冷却速率实现的。在玻璃化过程中，细胞主要在超快速冷却开始前通过暴露于高浓度的 CPA 进行脱水，以获得玻璃化的细胞内和细胞外状态。但玻璃化过程中 CPA 的高浓度可能对细胞有毒性，不过可以通过混合不同的 CPA 来降低每种 CPA 的相对浓度，并将胚胎 / 卵母细胞暴露于溶液的时间减到最少来控制毒性。
   • 操作要点
     • 用于玻璃化的冷冻溶液由渗透性（如 EG、G、DMSO、PG、乙酰胺等）和非渗透性（如蔗糖、海藻糖等）试剂组成，有些协议还会补充大分子物质如聚乙二醇等。为了提高冷却速率，胚胎 / 卵母细胞玻璃化的溶液体积已被大幅减小（0.1 - 2μL），并开发了特殊的载体系统，如开放式拉伸吸管、Flexipet - 剥脱移液器、Cryotop 等。玻璃化技术操作难度较大，因为胚胎 / 卵母细胞必须在极短时间（<1min）内处理非常浓缩、粘稠且体积小的玻璃化溶液，所以操作人员需要经过良好的培训。

人类胚胎和卵母细胞冷冻保存的实践经验及安全性

1. 胚胎冷冻保存的实践经验
   • 不同阶段的效果
     • 对于人类胚胎冷冻保存，早期卵裂阶段胚胎解冻后至少保留一半初始卵裂球被认为是存活的。在一项大型多中心研究中，14000 个早期卵裂阶段缓慢冷冻和解冻的胚胎中，73% 的胚胎至少有一半初始卵裂球仍然完整，移植后的临床妊娠率和着床率分别为 16% 和 8.4%。对于囊胚冷冻保存，常用甘油和蔗糖的组合作为冷冻溶液，报道的内细胞团和滋养层细胞至少 50% 存活的存活率在 69% - 98% 之间，着床率在 16% - 30% 左右。早期卵裂阶段人类胚胎已成功在多种基于 DMSO、EG 等的溶液中玻璃化，存活率约 60% - 80%，且有多个妊娠 / 分娩案例。囊胚玻璃化常用 EG 和 DMSO 的混合物作为溶液，报道的总体存活率在 70% - 99% 之间，着床率在 20% - 50% 左右。
   • 不同方法的比较
     • 在一些比较研究中，发现玻璃化和缓慢降温在胚胎存活和着床率方面各有优劣。例如，在某些情况下玻璃化的卵裂阶段和囊胚阶段胚胎解冻后存活率较高，但在有经验的群体中，玻璃化并不比缓慢降温有更高的怀孕概率。
2. 卵母细胞冷冻保存的实践经验
   • 不同方法的影响
     • 在缓慢冷冻卵母细胞方面，提高蔗糖浓度（从 0.1M 到 0.3M）可以提高脱水率以及 MII 卵母细胞的存活率和受精率。改变 CPA 的平衡温度、冰晶成核和将胚胎浸入液氮的操作，以及用胆碱替代钠或直接向卵母细胞细胞质中注射蔗糖等方法都能提高卵母细胞的存活率。但缓慢冷却的卵母细胞相对于新鲜对照组发育较慢。在玻璃化卵母细胞方面，常用的玻璃化溶液由渗透性（2.7M EG 和 2.1M DMSO）和非渗透性 CPA（0.5M 蔗糖）组成，改进的玻璃化技术提高了玻璃化人类卵母细胞解冻后的存活率和受精率，与新鲜对照卵母细胞相当。

参考文献：Konc J, Kanyó K, Kriston R, Somoskői B, Cseh S. Cryopreservation of embryos and oocytes in human assisted reproduction. Biomed Res Int. 2014;2014:307268. doi: 10.1155/2014/307268. Epub 2014 Mar 23. PMID: 24779007; PMCID: PMC3980916.