【摘要】目的探讨下调 LncRNA CRNDE 基因表达对 MAPK/ERK 通路及转录因子中相关基因的影响。

方法将 CRNDE 基因干扰 siRNA 转染人胶质瘤 U251 细胞系，并同时设置空白组及对照组，利用 Real Time PCR 检测细胞系中 MAPK/ERK 通路及转录因子中相关基因表达量的变化。

结果与空白组及对照组相比，转染组(si783、si809 )中相关基因 NF-κB、MEK 2、ERK1、ERK2、c-Myc、Raf1 表达量均明显下降(P<0.05 )，具有统计学意义。

结论 CRNDE 可能通过调节 MAPK/ERK 通路中及转录因子中一系列相关基因表达，增加胶质瘤细胞的增殖和迁移能力，同时抑制细胞凋亡。

【关键词】结直肠癌差异表达长链非编码 RNA；MAPK/ERK 通路；增殖；凋亡；迁移

前  言

CRNDE(colorectal neoplasia differentially expressed )是结直肠癌差异表达长链非编码 RNA，它在许多肿瘤组织中出现异常表达[1-2]，尤其是在胶质瘤中上调 14～32 倍[3]，从而推断 CRNDE 可能在胶质瘤演变过程中发挥重要功能。

为探讨下调 LncRNA CRNDE 基因表达对 MAPK/ERK 通路及转录因子中相关基因的影响，我们进行 U251 细胞的 siRNA 干扰，利用 Real Time PCR 检测细胞系中 MAPK/ERK 通路及转录因子中相关基因表达量的变化，进一步分析 CRNDE 对胶质瘤细胞增殖和迁移以及凋亡的影响。

资料与方法

1 临床资料

1.1 试剂与耗材

• 人脑胶质细胞瘤 U251(来源于胶质母细胞瘤 WHOIV 级)购自江苏齐氏生物科技有限公司。
• 试剂名称                                 生产厂家 
• CCK8 试剂盒                               BEYOTIME 
• Lipofectamine2000                          INVITROGEN 
• Annexin-VFITC/PI 细胞凋亡试剂盒            SOLARBIO 
• transwell 小室                                CONING 
• U251 细胞株                               ATCC 
• DMEM 培养基                             HYCLONE 
• 胎牛血清                                  HYCLONE 
• 青霉素                                    SIGMA 
• 链霉素                                    SIGMA 
• 谷氨酰胺                                  SIGMA 
• 0.25%胰蛋白酶                             SIGMA 
• 台盼蓝                                    SIGMA 
• DMSO                                    SIGMA 

1.2 U251 细胞的复苏与培养

将人脑胶质细胞瘤 U251 经过细胞复苏、细胞传代及细胞冻存等步骤完成。

1.3 CRNDE 干扰 siRNA 及目的基因引物序列的设计

1.4 转染

细胞用含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基,37℃、5%CO2 培养箱中培养、传代。转染前 24h，弃去培养基，加 PBS 洗 3 遍，加入 0.25 胰酶，37℃消化至待细胞回缩变圆，加终止液终止消化，1000r/min 离心 10min，弃上清，用不加双抗的完全培养基重悬，接种在六孔板中，每孔 0.5-2×105 个细胞，待细胞汇合度为 60%-80%。取三种 siRNA 各取 100pmol，稀释于 250Ml Opti-MEM 培养基，将 5μl Lipofecta- mine 2000 稀释于 250μlOpti- MEM 培养基，混匀室温放置 5min，将两管混合放置 20min。将六孔板内培养基弃掉，PBS 洗 2 遍，每孔加 1.5 mLOpti-MEM 培养基，将上述混合液加入相应孔。

我们将转染入无关序列 NC 的细胞作为阴性对照组；将未转染入任何序列的细胞作为空白组。

1.5 Real time PCR 检测

我们首先进行 CRNDE 引物设计 F: AAATCAAAGTGCTCGAGTG GTR: ACCTTCTTCTGCGTGACAAC。利用 Trizol 提取未转染及转染 CRNDE siRNA 的细胞总 RNA。将 1μg 总 RNA 反转录为 cDNA，基因组 DNA 的除去及反转录反应采用 TIANScript RT KIT 试剂盒（天根生物科技有限公司）。Real-time PCR 反应体系参考 SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）说明书，SuperReal PreMix Plus10μl，FW Primer  0.6μl，RV Primer 0.6μl，cDNA 模板 100ng，RNase-Free ddH2O 7.4μl。利用荧光定量 PCR 仪（Applied Biosystems）仪器进行实时定量 PCR，反应条件： 95℃  30s；95℃ 5s，53℃ 20s，72℃ 20s，延伸阶段收集荧光信号，40 个循环；55℃-95℃绘制熔解曲线。结束后确认 Real-time PCR 的扩增曲线和熔解曲线，每个样本重复三遍。利用 2-ΔΔCt 法计算目标基因的相对表达量。

结  果

1、对 U251 细胞 siRNA 干扰效率的验证（图 1）

利用 siRNA 在胶质瘤细胞 U251 中进行干扰，24、48h 后进行提取细胞内总 RNA，经过逆转录后进行 CRNDE 的 PCR 检测。si783、si809 干扰组在转染 24h 后 CRNDE 表达量为对照组的 8.6%和 12.6%；48h 后 CRNDE 表达量为对照组的 11.4%和 18.5%，均有统计学意义（P<0.05）。说明在转染 24、48h 后，si783、si809 对靶基因 CRNDE 表达干扰效果良好。

2、si783、si809 干扰 CRNDE 表达对相关目的基因表达的影响

我们对相关目的基因表达水平进行 PCR 分析，结果显示 Raf1、MEK2、ERK1、ERK2、c-Myc、NF-κB 的 RNA 表达量均有不同程度下降。Raf1 基因表达水平在 si783、si809 干扰组中分别下降为对照组的 31.7%和 72.2%；MEK2 基因表达水平降低为对照组的 31.3%和 41.9%；ERK1 基因表达水平降至对照组的 60.4%和 48.2%；ERK2 基因表达水平降至对照组 75.3%和 70.4%；与干扰组相比，si783、si809 干扰组中 NF-κB 表达水平降至 39.9%和 69.4%，c-Myc 表达水平降至 36.1%和 47.3%。