临床笔记：人工受精技术（下）

人工受精技术（ AI）是近30年来发展迅速的一种辅助生殖技术，极大的造福了人类。辅助生殖技术（ART）是指利用现代医学的最新成果用人工的手段代替自然生殖过程的一部分或者全部的技术。人类辅助生殖技术的分类如下：辅助生殖技术包括有性生殖和无性生殖，前者包括人工授精（夫精人工授精、他精人工授精和混合精液人工授精）、体外人工受精（IVF/ICSI）和代孕母亲；后者主要指克隆技术。

AI是指通过非性交的方法将精子置入女性生殖道或子宫内，使精子与卵子结合达到受精目的的一种医学助孕技术，是应用最早和最基础的人类辅助生殖技术。

AI根据所使用的精子来源分两大类，一是夫精人工授精（AIH）使用患者丈夫精液进行人工授精；二是供精人工授精（AID）使用志愿者供者精子进行人工授精。

AIH适应症：1、男方因少精（每毫升精液小于2千万个精子）、弱精、精液液化异常、性功能障碍（阳痿、早泄）、生殖器畸形、逆行射精等原因引起的不育。2、女方因宫颈粘液分泌异常、严重宫颈炎、宫颈糜烂、阴道痉挛、生殖道畸形以及心理因素导致性交不能等不育。3、部分免疫性不育。4、精液量过少或者过多，小于1毫升或大于8毫升。5、原因不明的不育（10%左右）。AIH禁忌症：1、输卵管双侧梗阻。2、男女任何一方患有生殖泌尿系统急性感染或性传播疾病。3、男女任何一方有严重的遗传、躯体疾病或精神心理疾病（尤其女方）。4、男女任何一方接触致畸量的射线毒物药品并处于作用期。5、男女任何一方有吸毒等不良嗜好。

AID适应症：不可逆的无精子症（比以往的条件要严格，以往严重的少精子症、弱精子症和畸形精子症，输精管复通失败也是适应症）；男方和/或家族患有不宜生育的严重遗传性疾病；母儿血型不合不能得到存活新生儿。AID禁忌症：输卵管双侧梗阻；2、男女任何一方患有生殖泌尿系统急性感染或性传播疾病。3、男女任何一方有严重的遗传、躯体疾病或精神心理疾病（尤其女方）。4、男女任何一方接触致畸量的射线毒物药品并处于作用期。5、男女任何一方有吸毒等不良嗜好。

AI前准备工作：1、准备生育证明：准生证、身份证、结婚证，计划二胎必须是当地政府颁发的正式文件，准生证效期1年。2、筛选患者：体格检查无法耐受促排卵及妊娠的内外科疾病，明确不孕原因，除外禁忌症。3、签署知情同意书：介绍治疗过程、成功的可能性（目前的成功率15%左右），可能的并发症及治疗方法（OHSS等）、治疗费用等，签署相关的知情同意书，包括超促排卵知情同意书、人工授精知情同意书、多胎妊娠减胎知情同意书、人工授精随访知情同意书和精子冷冻保存和复苏知情同意书。

Al常规实验室检查：男女双方肝功、肝炎四项、HIV、梅毒、血型、尿常规检查、血细胞分析（必做）；女方精子抗体、内膜抗体、磷脂抗体、优生四项；白带常规、细胞涂片、生殖道病原体（必做）；男方精液常规及精子运动轨迹分析（必做）其他检查包括：子宫输卵管碘油造影检查；超声排卵检测；胸片、心电图；家系中有遗传患者的，必要时一方或双方染色体检查（需要提前预约）.

AI前女方的药物促排卵和监测卵泡发育（适用于各种ART），人工受精可以在自然周期或药物促排卵周期进行，大多数助孕中在实施人工授精前均采用人工促排卵技术，以便能更好的促使卵泡的发育与成熟，保证子宫内膜与成熟卵泡发育的同步性，改善黄体功能，克服排卵障碍，人为控制排卵时间，从而达到提高受精的成功率；由于促排卵后多胎比例明显上升，因此应严格掌握促排卵的指征和促排卵药物的品种、剂量，控制好卵泡发育的个数，尽可能避免多胎妊娠。一旦发生多胎妊娠，及时实施选择性减胎术治疗。常用促排卵方案:CC+HCG;CC+HMG+HCG;HMG+HCG.CC+HCG于月经周期第5-9天口服CC，每日一次，每次50-100毫克，接着口服小剂量雌激素，乙烯雌酚0.25毫克/天或补佳乐0.5毫克/天，连续7-15天，自月经周期第11天起开始B超监测卵泡发育，主导卵泡直径达到18毫米以上时，子宫内膜厚度达到10毫米，肌肉注射HCG5000-10000IU.CC+HMG+HCG于月经周期第3-7天CC，每日一次，每次50-100毫克，月经周期第8、第10天每日注射HMG75-150IU，自月经周期11天起开始B超监测卵泡发育，根据卵泡发育情况，隔日注射HMG75-150IU，主导卵泡直径达到18毫米以上时，子宫内膜厚度达到10毫米，肌肉注射HCG5000-10000IU。HMG+HCG于月经周期第5天开始用药，起始剂量根据卵巢功能而定（预先做克罗米芬或HMG刺激试验），一般每天75-150U，至月经第10-11天开始观察卵泡发育和子宫内膜生长情况，视卵泡和子宫内膜生长程度决定用药剂量，一般可以75-300U/日，隔天做B超监测卵泡和子宫内膜的发育，调整用药剂量，直至最大卵泡直径达到18毫米以上，子宫内膜厚度达到10毫米，一次肌肉注射5000-10000IUHCG.FSH+HCG 1、于月经周期第5天开始用药，起始剂量一般150-300IU/日，月经第10天阴超观察卵泡发育和子宫内膜增长情况，根据卵泡和子宫内膜生长程度及血E2浓度调整用药剂量，隔天做B超监测卵泡和子宫内膜的发育，测血E2浓度，直至主卵泡直径达到18毫米以上，内膜厚度达到10毫米，血E2浓度达到1500-2500IU/L，一次肌肉注射5000-10000IU的HCG。2、这种用法主要针对卵巢功能较差，如多囊卵巢综合症（PCOS）患者，这些病人血LH水平较高，应用HMG促排卵容易引起刺激过度（因为HMG中含有75IU的FSH和75IU的LH），因此单独应用FSH效果更好些。

卵泡发育的监测：包括超声监测、激素测定(E2和LH分泌峰的监测)、宫颈评分（出现羊齿状结晶，综合评分在9分以上）、子宫内膜监测（A、B型子宫内膜，厚度在8毫米以上，妊娠率相对较高）。超声卵泡监测，进入监测期间后可以隔天或每天进行B超监测，卵泡成熟征象:卵泡直径大于或等于18毫米，部分卵泡内壁可见半月的突起，称为“卵丘征”。排卵征象：成熟卵泡消失或明显缩小或形状不规则，内部结构模糊，有时子宫凹内可见游离液体。激素测定：E2卵泡发育过程主要分泌雌二醇，循环中95%的E2来自优势卵泡，排卵24-36小时E2达到高峰，排卵后循环中的E2迅速下降，3天时间降到最低值，约为峰值的50%，排卵后一周左右黄体形成，E2再度升高形成第二峰，LH峰之前每个直径17毫米以上的卵泡E2水平平均250-500pg/ml。LH测定：卵泡成熟，E2达到高峰诱导LH峰的出现，LH峰引发排卵。血LH峰的起始在排卵前32小时，顶峰在排卵前16.5小时出现，尿LH峰比血LH峰晚出现6-7小时，与血LH水平有很好的相关性并尿LH检测快捷方便。在卵泡近成熟时每隔4-6小时测定一次，排卵一般在尿LH峰出现的 14-28小时内发生。宫颈评分：宫颈及分泌粘液随E2水平的变化呈现周期性变化，随着卵泡的发育，体内E2分泌增加，分泌粘液量增多，清澈透明象蛋清样，宫颈口松弛张开，拉丝度增加，出现羊齿状结晶。排卵后受孕激素作用，粘液分泌量减少，变为浓稠，形成粘液栓，宫颈口闭合。综合评分在9分以上，表明反应良好。子宫内膜检测：A型子宫内膜，呈三线状，在子宫纵切面可以看到三线形强回声；B型子宫内膜：内膜与周围肌层等回声，中线回声可见但不强；C型子宫内膜：内膜与周围肌层相比较呈均匀的强回声；A、B性子宫内膜，厚度在8毫米以上，妊娠率相对较高。目前主要采用阴道内超声检查的方法来检测排卵（包括卵泡大小和子宫内膜厚度/分型），必要时结合性激素测定（LH/E2）和宫颈粘液评分。

AI的时机：当主导卵泡直径大18-20毫米时；血E2水平大于300pg/ml;宫颈粘液+++-++++及典型羊齿状结晶；血或尿LH水平开始上升大于基础值的二倍。予以肌肉注射HCG10000IU，因为卵子排放大约在HCG注射后34-36小时。确定24-36小时后行IUI.

授精用精子制备：  1、上游法：（原理）利用活动精子自主泳动能力，会从试管底部向上游动，接近培养液的液面层。而活动能力差的精子、死精子、凝集的精子以及其它细胞成分则留在试管底部。通过吸取试管液面层的培养液，就可收集到活力较好的精子，达到优选精子的目的。上游法可以收集到更多的活力较好的、形态正常的精子，此法适用于正常精液标本，对于少、弱精症效果较差。2、密度梯度离心法：（原理）将培养液配成由低到高的不同浓度的梯度层，把液化的精液置于最上层。离心后，根据精子质量不同以及其它成分比重的不同，进入到不同的浓度层，只有活动力高的精子能够逆行穿越密度梯度到达分离液的底层，由此可摹集得到活动力高的精子。活力差的精子进入到低密度层，而白细胞及其它一些细胞进入到与精液相交界层内，用这种方法可将质量好的精子分离出来。其优点是精子得率高、能分清其他细胞及杂质，染色体损伤小。另外经过多层密度梯度离心还有可能分离出各种病原体，尤其对精液十分粘稠和少、弱精患者有较好的分离效果。

人工授精处理后精液标准：抽吸分离处理完毕的试管底部精液0.5毫升，混匀后取10ul样本，涂片并计数，其前向运动精子总数不得低于1百万，即可行宫腔内人工授精；如果最终结果低于该数值，应当立即向负责行IUI的临床医生报告，进行和病人沟通，同时征求病人的意见。

 逆行射精的精液处理：1、碱化尿液 在取精前二天，每天喝1.5升4-5%碳酸氢钠溶液，取精前1小时再喝200毫升5%左右的碳酸氢钠溶液，然后派去小便，夫妇同房或手淫，10分钟后收集小便。2、处理尿液  将取出尿液马上1200转/分钟，10分钟，弃去上清液，在沉淀物中加入精液洗涤液洗涤，最后加入0.8-1.0mlEarls精子培养液，混匀，放进37摄氏度含5%浓度的二氧化碳培养箱内上游20-30分钟，即刻授精。

冷冻精液的人工受精：（操作步骤）将快速复温的液化精液置于锥底试管内，加入Earls精子培养液或其它精子洗涤液1-2毫升，1000转/分钟离心10分钟，轻轻吸去上清液，再加入Earls精子培养液或其它精子培养液1毫升，轻轻摇，将试管竖直置于37摄氏度恒温箱内10分钟，吸取上层液体0.5-0.8毫升做IUI。（卫计委人类精子管理办法规定严禁使用供者新鲜精液做AID）.

 受精时间， 一般肌肉注射10000IU的HCG后36-48小时进行人工授精，因为卵子排放大约在HCG注射后36-40小时；有的生殖中心采用二次受精法，即24小时和40小时各授精一次，以提高授精率；也有的辅助生殖中心在超声波证实排卵后进行授精，当然也有侧血中LH峰值出现24小时授精。然而各种方法最后的授精率都没有显著差别，因为在排卵前后12小时内都是授精的理想范围，一般不会影响精卵授精的质量。

 受精方法及黄体支持与妊娠：取膀胱截石位，生理盐水擦洗外阴、阴道及宫颈，抬高臀部，注射器内先吸取培养液，接上授精导管，将培养液推出，冲洗授精导管，抽取0.5毫升制备好精子悬液，经宫颈进入5-6厘米处处，将精子液注入子宫，缓慢退出导管，原位休息15-30分钟。术后黄体支持与妊娠：1、黄体酮支持 于人工受精后第二天复查，如卵泡已排除，则每天肌肉注射20-40毫克的黄体酮，同时加用地屈孕酮10毫克po Bid;2、HCG支持 排卵后肌肉注射HCG2000IU，三天一次，一般用三次。值得一提的是有卵巢刺激过度综合征（HOSS）迹象或者已出现HOSS症状的患者，禁用或停用HCG，以免引起或加重HOSS。

术后随访和影响人工授精妊娠率的因素，人工受精后第15天，可以测定B-HCG.如果阳性，说明妊娠，继续黄体支持，隔日复查B-HCG、E2/P以便了解妊娠是否正常。目前发现影响人工授精的因素包括：适应症、患者年龄、自然周期与促排卵周期、HCG注射与授精时间、精子制备技术、授精技术和单次与重复授精。