积极修复，预后良好，很多根长充足、稳固的牙齿是不需要拔除的，进行牙齿的冠部修复或根加固，都是可以保留，继续使用的。目前的修复材料、方式多样化，可选择范围比较大。

日常可以注意：

1. 积极保护受伤牙齿，尽量避免咀嚼较硬的食物。

2. 如有牙震荡，必要时可以调颌，降低咬合避免接触（使根周受伤部分得到充分休养）；有明显缺损，建议及时修复。

3. 进食温度建议接近体温为宜，减少温度对损伤牙齿的不良刺激。

4. 如果出现持续加重的自发疼痛，建议及时就诊，对症治疗（如牙髓安抚、根管治疗等）。

5. 做好口腔卫生清洁，定期口腔健康检查。

不同的病因可以造成不同类型的牙体缺损，牙体组织不可再生，缺损后就不能自然修复、“愈合”。需要进行医疗修复，以免持续腐蚀，造成进一步的缺损加重。

牙体缺损的修复包括充填法和修复法。充填法可以简单理解为“补牙”。

修复法是用人工制作的修复体，恢复缺损牙体形态、外观和功能，不同类型的牙体缺损，可采用不同的修复方式，常用于牙体缺损修复治疗的修复体有全冠、部分冠、嵌体、桩核冠、贴面等。

牙体缺损是指由于各种原因引起的牙体硬组织不同程度的外型和结构的破坏和异常，表现为牙体缺失正常的生理解剖外形，造成正常牙体形态，咬合及邻接关系的破坏。对牙髓、牙周组织、咀嚼、发音、面容甚至全身健康等产生不良影响。

龋病是牙体缺损最常见原因之一，可以造成牙体硬组织脱矿和有机物分解，表现为牙体硬组织的变色、脱钙软化和龋洞形成，病变进一步发展，可造成牙冠破坏并可伴随牙髓充血、牙髓炎、牙髓坏死、根尖周炎、根尖周脓肿等；龋坏严重者，可造成牙冠部分或全部破坏，形成残冠或残根。

其次牙外伤也会引起牙齿的缺损，可引起牙折断，前牙牙外伤的发病率较高，根管治疗后等原因所致的失髓牙、隐裂牙等牙体自身强度下降，也可在正常咬合力下引起牙折断，牙外伤轻者表现为切角和牙尖局部小范围折裂，重者可出现整个牙冠折裂或冠根折断。

磨损是指过度的机械摩擦导致的牙体硬组织缺损，多表现为牙关咬合面的缺损，常由于喜食硬食等不良咀嚼习惯和磨牙症等引起全牙列重度磨损，会造成面部垂直距离降低导致口腔咀嚼功能颌美观的障碍甚至引起颞下颌关节病。

楔状缺损又称牙颈部非龋性缺损，常表现为尖牙、前磨牙唇/颊面的牙颈部楔形缺损。发病率随年龄而增高。病因有磨损、酸蚀、应力等因素。常伴有牙本质过敏、牙龈退缩，严重者可出现牙髓暴露甚至出现牙折断。

酸蚀症是牙齿长期受到酸的作用而发生脱矿，造成牙齿硬组织的缺损。常见于工作环境经常接触盐酸、硝酸等酸制剂的人群，长时间过量饮用酸性饮料的人群，以及有胃食管反流的人群等。主要表现为长期接触弱酸的牙面缺损呈刀削状的光滑表面或陷窝状形态。常伴有牙本质过敏，颜面染色、龋坏等。

发育畸形造成牙体缺损的发育畸型是指在牙发育和形成过程中出现形态、结构的异常，包括牙齿结构的发育畸形和牙齿形态的发育畸形。

①釉质发育不全症轻者，牙冠呈白垩色或褐色斑，严重者出现牙冠形态不完整。釉质钙化不良或者釉质硬度降低，牙釉质表面粗糙且有色素沉着。

②氟牙症：  是在牙发育期间，由于慢性氟中毒所致的牙本质牙体组织损害，牙冠表面出现白垩色或黄褐色斑块，重者出现釉质实质性缺损。

③四环素牙：又称四环素色素沉着，是在牙冠发育期间，由于受到四环素族药物的影响，而发生牙冠变色和釉质发育不全，牙冠呈灰褐色或青灰色，釉质透明度降低，失去光泽，严重者还可出现牙冠发育不全。

牙体缺损是指牙齿受到各种因素的影响而造成的硬组织丧失。针对不同程度的牙体缺损，可以选择充填治疗、修复治疗、桩核冠、根管治疗等方法。

1.充填治疗：对于缺损面积较小的牙体缺损，可以直接使用玻璃离子或复合树脂进行充填治疗。这种方法的优点是简单易行，在门诊即可完成，且效果良好。

2.修复治疗：如果牙体缺损过大或对美观要求较高，简单的充填治疗可能无法满足需求。在这种情况下，可以采用嵌体、贴面、部分冠或全冠等修复方法。

3.桩核冠：如果剩余的可利用牙体组织高度不足，无法形成足够的全冠固位形，通常需要桩核来提供支持和固位，即桩核冠。桩核冠是一种有效的治疗方法，能够为牙齿提供足够的支持和固位。

4.根管治疗：对于患牙存在牙髓和根尖周病变的患者，医生需要先为其进行根管治疗，即通过机械和化学方法，去除根管内的大部分感染物，并用药物严密充填根管，以消除炎症。在根管治疗后，医生才会为患者进行牙体缺损的治疗。牙体缺损的治疗需要根据具体情况选择合适的治疗方法。为了确保治疗效果和使用寿命，建议选择专业的口腔医院和医生进行治疗。

缺牙的危害。

桩核冠

一．适应症

• 临床牙冠中度以上缺损（2-4 壁缺损），剩余牙体无足够的固位条件，直接充填后无法提供冠修复体固位力者。
• 临床牙冠重度缺损，断面达龈下，但牙根有足够（可用）长度，经冠延长术或牵引术后可暴露出断面以下至少 1.5mm 的根面高度，磨牙未暴露根分叉者。
• 错位、扭转牙而非正畸适应证者。
• 畸形牙直接預備固位形不良者。

除此以外，患牙應具備完善的根管治療，根管充填滿意，根尖封閉良好，原有根尖周炎症得到控制等，方可行樁核冠修復。

臨床注意事項：

• 缺损范围过大，如 3-4 个轴壁缺损并深达龈下，不能用正畸或牙周冠延长手术获得足够的生物学宽度的患牙。有时仅个别牙壁缺损达龈下，无法获得 360°的完整牙本质肩领，尽管冠的边缘可以终止在正常牙体组织上，但该处由于生物学宽度不良可能导致牙周隐患，如果仍选择桩核冠修复，则应告知患者修复预后不良，让患者知情。
• 牙根或根管解剖形态不良，如牙根短小或根吸收致牙根过短或牙周萎缩致冠根比异常；牙根弯曲致根管桩道过短等，则采用桩核冠修复需谨慎。
• 未行完善的根管治疗，如欠充填或充填密度不足致根尖封闭不良，或根尖阴影过大，瘘管未消者，宜在根管治疗效果肯定时再行修复。
• 年轻恒牙缺损时，应尽量保存活髓，诱导根尖成形，促使牙根继续发育和根尖孔封闭。

2． 设计要求

• 桩的长度：至少 4mm 根尖封闭、骨内桩长＞1/2 骨内根长、桩的长度≥临床冠长。
• 桩的直径：桩的直径在 1/4~1/3 根径范围内对牙根的抗折性无明显影响。
• 牙本质肩领：原则上核的边缘与冠边缘之间应留有至少 1.5mm 的牙本质，厚度＞1mm。

3． 操作步骤（预成桩+树脂核）

（1） 牙体初预备

去除所有旧修复体、龋坏组织、薄壁弱尖，明确最终剩余牙体组织的量尽量保留 1.5mm 高、1mm 厚的肩领，但缺失牙体组织过多时，不要过多地向龈下预备，以免破坏正常的生物学宽度。

（2）去除暂封物

用慢速球钻将暂封物和根管口处牙胶尖去除干净，完全暴露根管口。

（3）桩道制备

• 器械： G 钻或 Peeso 钻、Parapost 成形钻。
• 步骤：确定根管长度（X 线片、牙体科病历）→扩孔钻上标记→按根管方向低速提拉进钻→带出切碎的根管充填糊剂及牙胶→按设计要求选择相应型号根管钻→预备至工作长度→加大 G 钻直径→直至没有牙胶溢出→最小的桩成形钻→逐步加大型号→直至与选用的桩匹配。

注意事项：

• 纤维桩预备时不用去除根管内壁上的倒凹，只要保证足够的长度和直径即可。
• 应将根管内壁上完全清理干净
• 如果后牙需要打多个纤维桩时要检查是否互相妨碍以及就位顺序等。
• 应冲洗预备根管，防止牙胶及封闭剂粘连附着于根管壁形成第二层玷污层（根管治疗时形成的玷污层称为第一玷污层），利于粘接。

（4） 根管清洁及消毒干燥

使用 75％乙醇消毒，蒸馏水冲洗，干燥

注意事项：

干燥时吸潮指尖剪去尖部，插入根管，稍微加以压力，上下小幅度贴根管壁四周提拉，均匀吸收水分。当扁圆形根管时可使用两根大锥度牙胶尖。

（5）试放纤维桩

用镊子夹取纤维桩插入预备根管，以桩能被动就位且取出有一定阻力为宜。禁用污染手套或止血钳。

（6）粘接

• 材料选择：考虑到根管系统粘接的复杂性，多选用自酸蚀双重固化系统或自粘结双重固化系统
• 酸蚀冲洗干燥：牙齿粘接条件较差的需要酸蚀，临床建议用注射器、三用枪和柱状毛刷，三者联合反复冲洗。如再配合超声波振荡冲洗更佳。
• 涂布粘接剂：将树脂粘接剂均匀地涂抹在根管、牙体的粘接面以及纤维桩的表面 2-3 次。用大锥度吸潮纸尖吸去多余的粘接剂，气枪吹 5s 使粘接剂中的溶剂快速挥发。
• 光照固化
• 将调好的树脂水门汀用口内注射头送入根管,从根尖部开始逐渐退到根管口.将纤维桩表面涂满调好的树脂水门汀，安放在根管内就位，保持压力 10 秒。将光固化灯对准纤维桩顶部光照 40 秒，以确保树脂水门汀固化

（7） 树脂核构建

• 使用核成型罩：将材料充入核成型罩，扣在桩上，保证材料与肩台紧密粘接。光照 20 秒
• 初步固化后去掉多余的树脂水门汀，再继续光照直至固化。核材料完全固化后，去掉核成型罩，修整冠核形态。
• 或者用冠核材料直接堆核，进行冠核的修复

冻卵，受到了越来越多的关注。但你对冻卵女性了解有多少？她们年龄多大？冻卵后她们又如何使用的？通过1篇荟萃分析我们来一起揭秘。

一、研究方法

研究人员按照系统综述和荟萃分析的首选报告项目（PRISMA）建议进行了系统综述。他们搜索了 PubMed、Scopus 和 Web of Science 从建库到 2021 年 1 月的文献，对发表日期没有限制。纳入的研究需为英文，且研究了计划性冻卵的使用者或潜在使用者的特征、最初信息来源以及卵子处置情况。提取的数据通过主题分析进行分析，纳入研究的方法学质量使用 QualSyst 标准进行评估。

二、研究结果

1. 研究筛选情况
   • 最初检索到 1074 条记录，其中 29 项研究符合纳入标准，包括 12 项定性研究和 17 项定量研究。调查的回复率在 38% - 85% 之间。
2. 女性特征
   • 计划性冻卵的使用者或潜在使用者大多为单身、受过高等教育、有工作，平均年龄为 37 岁。
3. 信息来源
   • 媒体和朋友是计划性冻卵最初知识的最常见来源，而健康专业人员则是较不常见的来源。
4. 卵子使用情况
   • 大多数计划性冻卵者没有尝试使用冷冻卵子怀孕，但她们并不后悔进行了该过程。

三、讨论与启示

1. 人口特征与卵子使用
   • 计划性冻卵的大多数使用者或潜在使用者具有特定的人口统计学特征，并且最终大多没有使用她们冷冻保存的卵子。这可能是由于多种原因，比如在冻卵后的生活中，她们的生育计划发生了改变，或者虽然有生育的想法但尚未尝试使用冷冻卵子。
2. 卵子处置的选择
   • 对于未使用的卵子，存在多种处置方式。可以选择丢弃，这可能是因为女性认为自己不再需要这些卵子，或者缺乏合适的使用途径。也可以选择捐赠给其他女性，为那些有生育困难的女性提供帮助。此外，还可以捐赠给研究机构，用于相关的科学研究，以推动生育医学的发展。
3. 对健康专业人员的指导意义
   • 了解计划性冻卵潜在使用者的主要特征，健康专业人员可以更加主动地宣传正确的冻卵知识，包括冻卵的风险、成功率以及后续可能面临的问题等。同时，在咨询过程中，也可以根据女性的年龄、婚姻状况和生育计划等因素，提供更加个性化的建议，帮助她们做出更有效的决策。

参考来源：Giannopapa M, Sakellaridi A, Pana A, Velonaki VS. Women Electing Oocyte Cryopreservation: Characteristics, Information Sources, and Oocyte Disposition: A Systematic Review. J Midwifery Womens Health. 2022 Mar;67(2):178-201. doi: 10.1111/jmwh.13332. Epub 2022 Feb 13. PMID: 35156301.

原始卵泡位于卵巢皮质中，处于静止状态。其数量在出生时就已确定（每个卵巢大约 60 万到 100 万个），并在儿童期和整个生育期持续逐渐减少，因为原始卵泡会被募集并离开静止状态。

大多数原始卵泡在初次募集后发生闭锁，无法达到窦状卵泡阶段，只有少数能继续生长直至排卵，在生育期大约排卵 450 次左右，只有极少数卵泡能发育成有受精能力的卵子。当原始卵泡几乎耗尽，只剩下大约 1000 个原始卵泡时，就会导致绝经。

随着女性生育观念的转变以及医学技术的飞速发展，冻卵技术作为一种生育力保存的手段，正逐渐走进大众的视野。这一技术为女性在面临生育挑战时提供了一种可能的解决方案，无论是因为职业发展、个人生活规划，还是由于疾病治疗等原因导致的生育延迟或生育风险增加。

一、冻卵技术的原理与方法

冻卵技术的核心原理是在极低的温度下保存卵子，使其代谢活动几乎停止，从而延长卵子的存活时间。目前主要有两种常见的冻卵方法：慢冻法和玻璃化冷冻法。

慢冻法是一种较为传统的方法，它通过逐步降低温度，让卵子在这个过程中逐渐适应低温环境。在这个过程中，会使用一些冷冻保护剂来减少冰晶的形成，因为冰晶可能会对卵子的结构造成损伤。具体来说，卵子首先在含有一定浓度冷冻保护剂的溶液中进行预处理，然后以相对缓慢的速度降温，经过多个阶段的温度调控，最终将卵子储存于液氮中，温度可达 -196°C。

玻璃化冷冻法则是一种更为先进的技术，它能够在更短的时间内实现卵子的冷冻。这种方法使用了更高浓度的冷冻保护剂，并且通过极快的冷却速度，使卵子在瞬间从液态转变为一种类似玻璃的固态，从而避免了冰晶的形成。玻璃化冷冻法在保护卵子的结构和功能方面具有一定的优势，因此近年来受到了越来越多的关注和应用。

二、冻卵技术的适用人群与临床应用

1. 癌症患者的生育力保存 对于许多癌症患者，尤其是年轻女性，化疗、放疗等治疗手段可能会对卵巢功能造成不可逆的损害，导致生育能力丧失。冻卵技术为这些患者提供了在接受治疗前保存生育能力的机会。例如，在一些血液系统癌症或生殖系统癌症的治疗中，医生会建议患者在开始治疗前考虑冻卵。通过采集卵子并进行冷冻保存，患者在治愈癌症后，如果有生育的意愿，就有可能使用这些冷冻的卵子尝试受孕。
2. 延迟生育的女性 随着社会的发展，越来越多的女性选择在事业有成之后再考虑生育问题。然而，女性的生育能力会随着年龄的增长而逐渐下降，尤其是在 35 岁之后，这种下降趋势更为明显。冻卵技术为这些希望延迟生育的女性提供了一种保障。她们可以在年轻、生育能力较强的时候将卵子冷冻保存，等到合适的时机再尝试受孕。

三、冻卵技术的临床效果与影响因素

1. 卵子的存活率和受精率 冻卵技术的临床效果受到多种因素的影响。从卵子的存活率和受精率来看，不同的研究报道结果有所差异。一般来说，玻璃化冷冻法在卵子存活率和受精率方面可能表现出一定的优势。一些研究显示，玻璃化冷冻法的卵子存活率可达 90% 以上，受精率也在 70% - 90% 左右；而慢冻法的卵子存活率在 50% - 70% 左右，受精率在 60% - 70% 左右。然而，这些数据并不是绝对的，实际的存活率和受精率还会受到卵子本身的质量、冷冻保护剂的使用、冷冻和解冻的操作过程等多种因素的影响。
2. 怀孕率和活产率 冻卵后的怀孕率和活产率也是衡量技术效果的重要指标。随着技术的不断发展，冻卵后的怀孕率和活产率也在逐步提高。例如，慢冻法的活产率从早期的较低水平逐渐上升，从 1996 - 2004 年的每移植 21.6% 提高到 20，02 - 2004 年的 32.4%；玻璃化冷冻法的活产率和持续怀孕率从 2004 年之前的 29.4% 提高到 2004 年之后的 39%。但需要注意的是，怀孕率和活产率还与女性的年龄、身体状况、受孕环境等多种因素密切相关。

冻卵技术作为一种新兴的生育力保存手段，为女性的生育选择提供了更多的可能性。然而，我们也应该清醒地认识到，这项技术仍然处于不断发展和完善的过程中，面临着诸多技术挑战和伦理法律问题。只有通过不断的研究和探索，才能使冻卵技术更好地服务于女性的生育健康，为更多女性实现生育梦想提供有力的支持。

参考文献：Cacciottola L, Donnez J, Dolmans MM. Ovarian tissue and oocyte cryopreservation prior to iatrogenic premature ovarian insufficiency. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2022 May;81:119-133. doi: 10.1016/j.bpobgyn.2021.09.010. Epub 2021 Nov 15. PMID: 34887172.

在当今社会，女性面临着多种可能影响生育能力的因素，如癌症治疗、延迟生育等。因此，生育力保存成为了一个重要的研究领域，而冻卵技术作为其中的一种方法，正逐渐受到关注。其目的在于为面临生育风险的女性提供一种保存生育能力的选择，以便在未来需要时能够实现生育梦想。

冻卵技术的原理

为了长期保存细胞的活性，需要将细胞置于极低的温度下，使其进入一种类似于 “暂停生命活动” 的状态。对于哺乳动物细胞来说，通常使用的储存温度是 -196°C（液氮的温度）。在这个温度下，水呈固态，生物反应停止，对冻存细胞的主要威胁被认为是背景辐射对 DNA 造成的损伤。

然而，冻卵过程中最关键的是要避免在温度变化过程中对卵子造成损伤。当水冷却到冰点以下时会形成冰晶，冰晶的体积比液态水大，会对细胞内的细胞器造成压力和剪切力，导致细胞受损。因此，避免冰晶形成是成功冻卵的首要目标。此外，随着水的冻结，溶质被排除在固体之外，会使剩余未冻结溶液的溶质浓度升高，对细胞内蛋白质产生毒性，避免这种溶液效应是第二个目标。在解冻过程中，如果升温缓慢，会有自由水解冻和再结晶的危险，而快速升温则可能导致细胞外渗透压突然下降，引起自由水快速流入细胞，造成细胞肿胀和损伤，即渗透压冲击，避免这种情况是第三个目标。

为了实现这些目标，所有成功的冻卵方法都使用了一种叫做冷冻保护剂的化学物质。冷冻保护剂分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂是小分子物质，能够穿透细胞膜，与水分子形成氢键，防止冰晶形成，并在一定浓度下可使水形成玻璃化状态（一种固态但不膨胀的状态）。常用的渗透性冷冻保护剂有丙二醇（PROH）等。非渗透性冷冻保护剂则留在细胞外，通过从细胞内吸取自由水来使细胞内空间脱水，从而增加渗透性冷冻保护剂在细胞内的浓度，进一步协助防止冰晶形成。在解冻过程中，非渗透性冷冻保护剂还可以防止因细胞内冷冻保护剂不能快速扩散出去而导致的渗透压冲击，常用的非渗透性冷冻保护剂有蔗糖等。

冻卵的方法

1. 慢冻法（Slow - Freeze）
   • 慢冻法在卵子仍处于代谢状态时使用较低的初始冷冻保护剂浓度，以降低毒性。冷冻保护剂通常在室温下添加，然后温度逐渐降低（约 2°C/min）到 -6°C 的播种温度。在这个温度下，通过用冰冷的器械触碰冻存容器的外部，引入一个小冰晶作为种子，诱导溶液中的冰晶形成。然后溶液在这个温度下保持一段时间（如 10 - 30 分钟）以达到平衡，之后温度再逐渐降低到 -32°C。在这个过程中，冰晶在细胞外介质中逐渐生长，冷冻保护剂浓度逐渐增加，特别是在细胞内空间，通过非渗透性冷冻保护剂进一步脱水。最后将冷冻容器投入液氮中。
   • 在解冻时，为了防止冰晶再结晶，需要快速升温，但要注意避免渗透性冷冻保护剂在细胞内高浓度引起的渗透压冲击，因此需要使用额外的非渗透性冷冻保护剂。随着渗透性冷冻保护剂逐渐从卵子中扩散出来，非渗透性冷冻保护剂的浓度逐渐降低，直到卵子被放回标准培养基中。
2. 快速冷冻法（Vitrification）
   • 快速冷冻法（玻璃化冷冻）在室温下向细胞中添加高浓度的渗透性冷冻保护剂，由于这种高浓度的冷冻保护剂毒性较大，卵子不能在这个温度下长时间停留。经过短暂的平衡后，卵子直接投入液氮中。为了进一步防止冰晶形成，使用极快的冷却速度。在解冻时，也需要极快的升温速度以防止冰晶再结晶。

冻卵技术的临床应用

1. 癌症患者的生育力保存
   • 对于新诊断出癌症且面临绝育治疗的女性来说，冻卵是一种保存生育能力的方法。化疗和放疗等癌症治疗方法可能会导致卵巢功能衰竭，而冻卵可以在治疗前进行。例如，卵巢皮质含有大量原始卵泡，可以通过腹腔镜采集卵巢皮质，然后进行冻存。或者也可以采集处于生发泡阶段的卵子进行冻存，尽管生发泡卵子的体外成熟技术还不太可靠。
   • 在癌症患者中使用冻卵技术也存在一些问题，如刺激卵泡和采集卵子所需的时间可能会延迟癌症治疗，而且对于患有全身性或播散性恶性肿瘤的患者，移植冻存的卵巢组织需要谨慎，因为可能存在残留的恶性细胞。
2. 延迟生育
   • 随着社会的发展，越来越多的女性选择延迟生育。由于年龄的增长会导致生育能力下降，冻卵为这些女性提供了一种在年轻时保存卵子的方法，以便在未来想要生育时使用。然而，目前对于冻卵技术在延迟生育方面的应用，还缺乏长期的数据，例如需要冻存多少卵子才能实现满意的怀孕率还不确定。
3. 伦理问题及其他应用
   • 冻卵技术为那些反对胚胎冷冻保存的夫妇提供了一种选择，也可以用于一些胚胎冷冻保存不合法的国家。此外，冻卵还可以用于卵子捐赠，通过冻存捐赠者的卵子，可以解决传统卵子捐赠中存在的一些问题，如捐赠者的可用性、成本、同步捐赠者和接受者的日程安排等。

冻卵技术的临床结果

1. 存活率和受精率
   • 不同的研究报道了不同的卵子存活率和受精率。例如，一些研究使用慢冻法报道的卵子存活率在 50% - 70% 左右，受精率 60% - 70% 左右；而使用玻璃化冷冻法报道的卵子存活率和受精率可能更高，如一些研究中卵子存活率可达 90% 以上，受精率也在 70% - 90% 左右。
2. 怀孕率和活产率
   • 从临床结果来看，冻卵后的怀孕率和活产率也在不断提高。慢冻法的活产率从 1996 - 2004 年的每移植 21.6% 提高到 2002 - 2004 年的 32.4%；玻璃化冷冻法的活产率和持续怀孕率从 2005 年之前的 29.4% 提高到 2005 年之后的 39%。同时，冻卵后的流产率也呈现出随着活产率提高而下降的趋势。

参考文献：Jain JK, Paulson RJ. Oocyte cryopreservation. Fertil Steril. 2006 Oct;86(4 Suppl):1037-46. doi: 10.1016/j.fertnstert.2006.07.1478. PMID: 17008147.

在人类辅助生殖领域，冷冻保存技术是一项非常重要的技术手段。它包括精子、胚胎和卵母细胞的冷冻保存。研究表明，精子和胚胎的冷冻保存已经成为常规操作，卵母细胞的冷冻保存也正逐渐在临床实践中得到更广泛的应用。

胚胎冷冻保存降低了新鲜胚胎移植的数量，提高了体外受精（IVF）周期的有效性。数据显示，同时进行新鲜胚胎和冷冻胚胎移植的女性，通过使用冷冻胚胎可获得额外 8% 的生育机会。卵母细胞冷冻保存相较于胚胎冷冻有更多优势，比如为因肿瘤治疗或慢性疾病面临生育力丧失风险的女性保存生育能力、用于卵子捐赠以及推迟生育等，还能避免胚胎冷冻所涉及的宗教和伦理道德问题。

冷冻保存技术的基本原理和方法

1. 传统缓慢降温法
   • 冷冻保护剂的作用
     • 在胚胎和卵母细胞的冷冻保存过程中，防止冰晶形成和有毒溶质浓度过高是关键，这两者是导致细胞死亡的主要原因。为了实现这一点，细胞悬浮的冷冻溶液中需要添加冷冻保护剂（CPA）。CPA 分为细胞内 / 膜渗透性（如丙二醇、二甲基亚砜、甘油、乙二醇等）和细胞外 / 膜非渗透性化合物（如蔗糖、海藻糖、葡萄糖、蛋白质、脂蛋白等）。渗透性 CPA 通过渗透梯度置换水分，部分占据细胞内水的位置，而非渗透性 CPA 则增加细胞外渗透压，在冷冻前支持细胞脱水，解冻后防止水分快速进入细胞。
   • 不同阶段的处理
     • 对于人类胚胎和卵母细胞，在缓慢降温前，通常会让其暴露于渗透性和非渗透性 CPA 的混合物中 10 分钟进行脱水。对于早期卵裂阶段的胚胎和卵母细胞，常用低浓度的丙二醇（1.5M）和蔗糖（0.1 - 0.25 - 0.5M），而囊胚阶段的胚胎则常用甘油。以最初成功的小鼠和牛胚胎冷冻保存协议为例，是将胚胎以 - 0.3°C - 0.5°C/min 的缓慢降温速率冷却到 - 80°C - 120°C，但这个过程很长（几个小时）。后来有了改进的方法，如将绵羊和牛胚胎以 0.3°C/min 的速率缓慢冷却到 - 30 - 35°C 后，再浸入液氮中，大大缩短了冷冻过程（1.0 - 1.5 小时）。人类胚胎一般是以 0.3°C/min 的低冷却速率冷却到约 - 30°C - 40°C，然后以 - 50°C/min 的速率增加冷却到 - 80°C - 150°C 后再浸入液氮中。在缓慢降温过程中，手动在 5 到 - 8°C 之间诱导冰晶成核（播种），缓慢冷却到 - 30°C - 40°C 后再快速冷却到 - 196°C 的胚胎 / 卵母细胞，需要在 25°C - 37°C 的温水中快速解冻，然后逐步去除 CPA 进行细胞再水化。
2. 玻璃化（超快速冷冻保存）法
   • 技术原理
     • 玻璃化是一种不同于缓慢降温的冷冻保存方法，它是在低温下通过极端提高粘度使溶液固化，避免冰晶在细胞内和细胞外空间形成。这是通过高浓度的 CPA（4 - 8mol/L）和极高（超快速）的冷却速率实现的。在玻璃化过程中，细胞主要在超快速冷却开始前通过暴露于高浓度的 CPA 进行脱水，以获得玻璃化的细胞内和细胞外状态。但玻璃化过程中 CPA 的高浓度可能对细胞有毒性，不过可以通过混合不同的 CPA 来降低每种 CPA 的相对浓度，并将胚胎 / 卵母细胞暴露于溶液的时间减到最少来控制毒性。
   • 操作要点
     • 用于玻璃化的冷冻溶液由渗透性（如 EG、G、DMSO、PG、乙酰胺等）和非渗透性（如蔗糖、海藻糖等）试剂组成，有些协议还会补充大分子物质如聚乙二醇等。为了提高冷却速率，胚胎 / 卵母细胞玻璃化的溶液体积已被大幅减小（0.1 - 2μL），并开发了特殊的载体系统，如开放式拉伸吸管、Flexipet - 剥脱移液器、Cryotop 等。玻璃化技术操作难度较大，因为胚胎 / 卵母细胞必须在极短时间（<1min）内处理非常浓缩、粘稠且体积小的玻璃化溶液，所以操作人员需要经过良好的培训。

人类胚胎和卵母细胞冷冻保存的实践经验及安全性

1. 胚胎冷冻保存的实践经验
   • 不同阶段的效果
     • 对于人类胚胎冷冻保存，早期卵裂阶段胚胎解冻后至少保留一半初始卵裂球被认为是存活的。在一项大型多中心研究中，14000 个早期卵裂阶段缓慢冷冻和解冻的胚胎中，73% 的胚胎至少有一半初始卵裂球仍然完整，移植后的临床妊娠率和着床率分别为 16% 和 8.4%。对于囊胚冷冻保存，常用甘油和蔗糖的组合作为冷冻溶液，报道的内细胞团和滋养层细胞至少 50% 存活的存活率在 69% - 98% 之间，着床率在 16% - 30% 左右。早期卵裂阶段人类胚胎已成功在多种基于 DMSO、EG 等的溶液中玻璃化，存活率约 60% - 80%，且有多个妊娠 / 分娩案例。囊胚玻璃化常用 EG 和 DMSO 的混合物作为溶液，报道的总体存活率在 70% - 99% 之间，着床率在 20% - 50% 左右。
   • 不同方法的比较
     • 在一些比较研究中，发现玻璃化和缓慢降温在胚胎存活和着床率方面各有优劣。例如，在某些情况下玻璃化的卵裂阶段和囊胚阶段胚胎解冻后存活率较高，但在有经验的群体中，玻璃化并不比缓慢降温有更高的怀孕概率。
2. 卵母细胞冷冻保存的实践经验
   • 不同方法的影响
     • 在缓慢冷冻卵母细胞方面，提高蔗糖浓度（从 0.1M 到 0.3M）可以提高脱水率以及 MII 卵母细胞的存活率和受精率。改变 CPA 的平衡温度、冰晶成核和将胚胎浸入液氮的操作，以及用胆碱替代钠或直接向卵母细胞细胞质中注射蔗糖等方法都能提高卵母细胞的存活率。但缓慢冷却的卵母细胞相对于新鲜对照组发育较慢。在玻璃化卵母细胞方面，常用的玻璃化溶液由渗透性（2.7M EG 和 2.1M DMSO）和非渗透性 CPA（0.5M 蔗糖）组成，改进的玻璃化技术提高了玻璃化人类卵母细胞解冻后的存活率和受精率，与新鲜对照卵母细胞相当。

参考文献：Konc J, Kanyó K, Kriston R, Somoskői B, Cseh S. Cryopreservation of embryos and oocytes in human assisted reproduction. Biomed Res Int. 2014;2014:307268. doi: 10.1155/2014/307268. Epub 2014 Mar 23. PMID: 24779007; PMCID: PMC3980916.