原创作者：郝一丹 杨士伟 周玉杰 胡大一    京东健康 心脏中心

（1首都医科大学附属北京安贞医院，北京市心肺血管疾病研究所，2北京大学人民医院）

心脏不仅仅是一个血液动力泵，它也是一个需要新陈代谢能量的器官[1]。事实上，心脏代谢改变是人类心肌缺血的主要和上游病理生理表现[2]。冠状动脉血流阻断后几秒钟内出现能量代谢紊乱，随后出现心肌的机械、电生理和结构异常。迄今为止，缺血性心脏病（ischemic heart disease，IHD）的标准治疗，包括血运重建（溶栓、经皮冠状动脉介入治疗和冠状动脉旁路移植术）、抗凝治疗（抗血小板和抗凝剂）、稳定/逆转动脉粥样硬化的进展（动脉粥样硬化危险因素的控制）、以及抑制心肌重塑（交感和肾素-血管紧张素-醛固酮系统抑制剂），主要针对冠状动脉解剖和心肌代谢变化的结果，而不是针对代谢变化本身[2-8]。此外，几乎所有上述治疗均通过直接或间接影响心率、血压或心肌灌注来发挥心脏保护作用。心肌能量代谢治疗（myocardial energy metabolic therapy，MEMT）通过调节心肌细胞的能量合成和利用发挥保护作用，对心率、血压和灌注无明显影响[9， 10]。由于存在心血管残留风险，MEMT有望成为IHD的上游治疗手段[11]。

自1927年发现磷酸肌酸（creatine phosphate，CrP）[12]和1929年发现三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）[13]以来，高能磷酸盐（high-energy phosphates，HEPs）的生化、生理和药理特性逐渐被发现。与葡萄糖、游离脂肪酸或氨基酸的单一代谢过程不同，HEPs生物合成和降解的途径和调控涉及所有代谢底物。此外，由于HEPs在不同的细胞和亚细胞的细胞器中产生和消耗，HEPs的跨膜转运也是一个复杂的过程，需要许多特殊转运体和催化酶的辅助[14]。因此，尽管HEPs已被发现近一百年，临床医生仍有许多需要学习和研究的内容。近年来，一系列基础和临床研究表明，外源性HEPs对IHD具有较强的保护作用[15-19]。这些结果在我们的前期研究中也得到了证实[16， 20， 21]。

以往的综述要么关注于过于复杂的HEPs的细胞和分子机制[14， 22]，要么关注于临床证据过于简单，以至于临床医生无法了解其病理生理和药理作用[15， 16]。这篇文章的目的是在临床和基础研究之间架起一座桥梁。

一、高能磷酸盐及其转化

人们通常认为能量会集中在含有磷酸基的化学键中，而磷酸基在水解时会产生能量[23]。低能量磷酸盐通常以磷酸酯键相连，释放2-3千卡每摩尔的能量。HEPs包括多种水解能高于7千卡/摩尔的磷酸盐化合物[24]。ATP和CrP被认为是人体的主要HEPs。ATP是细胞内的能量货币，大部分不是从头合成的，而是由线粒体氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OP）和胞浆底物水平磷酸化（substrate phosphorylation，SP）产生的二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）（图1）[25， 26]。因此，在任何给定的时间，ATP和ADP的总量保持相当的恒定，并不断循环[27]。而CrP是能量的储存和运输载体，通过“磷酸肌酸穿梭”将高能磷酸键从ATP产生部位转移到ATP利用部位（图1）[28-35]。正常情况下，人体ATP总量约为0.1 mol（约50g）。然而，人体细胞所消耗的能量需要每天水解100至150摩尔（约50至75公斤）的ATP[36]。这意味着每个ATP分子在一天内循环1000到1500次。ATP和CrP的结合，也被称为磷酸原系统，是最快速可用的能量来源。不幸的是，磷酸原系统储存的能量是有限的，仅能为几秒钟的最大活动提供能量[37]。

ATP是细胞内的能量现钞，主要由线粒体氧化磷酸化和胞浆底物磷酸化ADP合成。CrP是能量的储存和运输载体，通过“磷酸肌酸穿梭”将高能磷酸键从ATP产生部位转移到ATP利用部位。

ADP，二磷酸腺苷；ATP，三磷酸腺苷；CK，肌酸激酶；CrP，磷酸肌酸；HEP，高能磷酸盐；OP，氧化磷酸化；SP，底物磷酸化

CrP，又称磷酸肌酸或磷酸化肌酸，是一种分子式为C4H10N3O5P的小分子化合物，分子量为211道尔顿。化学结构中有一个高能磷酸键（N~P）。相比之下，ATP具有较为复杂的分子结构（C10H16N5O13P3）、较大的分子量（507道尔顿）和两个高能磷酸键（O~P）。然而，CrP的N~P键（10.3 kcal/mol）比ATP的任何一个O~P键（7.3 kcal/mol）具有更多的能量（图2）[38]。因此，CrP可以很容易地提供足够的能量，并通过“磷酸肌酸穿梭”作为ATP重建的高能磷酸键供体[28]。

CrP的化学结构中存在一个高能磷酸键(N~P)。相比之下，ATP具有较为复杂的分子结构和两个高能磷酸键(O~P)。然而，CrP的N~P键（10.3 kcal/mol）比ATP的任何一个O~P键（7.3 kcal/mol）具有更多的能量。

ATP, 三磷酸腺苷; CrP, 磷酸肌酸; HEP, 高能磷酸盐; ∆G, Gibbs自由能变化

不同组织中HEPs含量差异显著。最高水平的HEPs存在于肌肉、心脏、大脑、精子和视网膜[14]。体内HEPs的浓度和分布可以用31P磁共振波谱（31P-magnetic resonance spectroscopy，MRS）非侵袭性测定[39， 40]。31P-MRS测得的心肌CrP/ATP比值反映了心肌细胞的活力和能量代谢状态[41]。在大范围的心脏负荷下，CrP/ATP比值基本不变，且与恒定的游离ADP浓度一致[42， 43]。 CrP/ATP比值的临界值（>1.60和<1.60）是回顾性建立的，需要进行前瞻性评估，它是更强的心血管死亡预测指标[44]。心肌缺血时，这一比率降低[45， 46]。

二、 内源性磷酸肌酸的生物合成、降解和代谢

CrP的生物合成始于由三种必需氨基酸精氨酸、甘氨酸和蛋氨酸合成肌酸（图3）[14]。先由甘氨酸分子与精氨酸的氨基合成胍基乙酸（guanidinoacetic acid，GAA），然后在GAA的氨基上甲基化生成肌酸。人们一般认为，肌酸合成的主要途径包括肾脏中GAA的形成和肝脏中的甲基化[47-49]。这些反应分别由两种限速酶催化，即L-精氨酸:甘氨酸脒基转移酶（L-arginine:glycine amidinotransferase，AGAT）和S-腺苷-L-蛋氨酸:N-胍基乙酸甲酯甲基转移酶（N-guanidinoacetate methyltransferase，GAMT）[47-50]。为了完成磷酸化过程，肌酸被一种特定的Na+和Cl-依赖的浆膜转运蛋白运送到肌肉、心脏和大脑等组织[51]。CrP的合成是由肌酸激酶（CK）催化的，它是由不同结构基因产生的M和B（M =肌肉，B =大脑）亚基的二聚体。可能包括三个同功酶:BB、MB和MM。心肌组织中包含大量的CK-MB（约占CK总活性的25-46%，而在骨骼肌CK-MB仅占CK总活性的不到5%），所以在心肌梗死患者血清CK与CK-MB同步上升[14, 52, 53]。

与生物合成不同，肌酸和CrP的降解是不可逆的，经过非酶环化生成肌酐（图3）[54, 55]。每天几乎恒定比例的肌酸（1.1%）和CrP（2.6%）被转化为肌酐，从而使总的肌酸池（肌酸+CrP）的整体转化率为~ 1.7%/天[56]。例如，在一个70公斤的人含有大约120克的肌酸池，大约2克/天转化为肌酐，须通过外源性补充肌酸或CrP进行替代[14]。

CrP的生物合成始于由三种必需氨基酸：精氨酸、甘氨酸和蛋氨酸合成肌酸。肌酸合成的主要途径包括肾脏合成GAA及肝脏的甲基化过程。这些反应分别由AGAT和GAMT催化。然后肌酸通过特定的Na+和Cl-依赖的细胞膜转运蛋白转运到心脏。肌酸和CrP的降解是一个不可逆的非酶催化的环化反应，生成肌酐。降解的肌酸和CrP通过饮食或从头合成补充。

ADP, 二磷酸腺苷; AGAT, L-精氨酸:甘氨酸脒基转移酶; ATP, 三磷酸腺苷; CK, 肌酸激酶; CrP, 磷酸肌酸; GAA, 胍基乙酸; GAMT, S-腺苷-L-蛋氨酸:N-胍基乙酸甲酯甲基转移酶

三、 缺血/再灌注时的心肌代谢变化：底物、通路、代谢中间产物及嘌呤核苷酸循环

冠状动脉血流阻塞后几秒钟内，缺血区氧合血红蛋白迅速耗竭。心肌产生能量的主要途径由线粒体有氧氧化变为胞浆无氧糖酵解。心肌能量代谢的主要底物也由游离脂肪酸变为葡萄糖[57, 58]。然而，糖酵解合成的HEPs远远不能满足心脏的能量需求。在此条件下，缺血心肌优先利用内源性CrP所含的能量，其次为ATP、ADP、腺苷单磷酸（adenosine monophosphate，AMP）（图4）[62-67]。AMP在5’-核苷酸酶的作用下还可以进一步分解成腺苷、次黄嘌呤等（图4）[62, 68]。上述反应最终导致细胞内腺嘌呤核苷酸池（ATP + ADP + AMP）的减少，高能磷酸前体显著减少。如果心肌在短时间内恢复有氧氧化，则可以将AMP再氧化为ADP和ATP来补充能量。如果不能在短时间内恢复有氧氧化，则不可能再氧化AMP到ADP或ATP。此外，糖酵解过程产生的乳酸和其他中间产物蓄积在心肌细胞中（图4）[57, 58]。缺血10分钟后，细胞内pH降至5.8~6.0[69, 70]，无氧糖酵解使ADP再磷酸化为ATP的速率因酸中毒而减慢[71]。

继发于代谢变化的心肌缺血/再灌注损伤表现为：细胞内Ca2+超载、致心律失常性中间产物和氧自由基蓄积、心肌细胞膜不稳定、心肌细胞电生理变化、线粒体损伤、血小板聚集等。

缺血心肌优先利用CrP所含的能量，其次为ATP、ADP、AMP，而AMP可进一步分解为腺苷和次黄嘌呤，导致细胞内腺嘌呤核苷酸池减少。此外，糖酵解产生的乳酸蓄积累在心肌细胞中，导致细胞内酸中毒。高能磷酸盐合成减少使细胞内维持钙稳态的四种机制中的三种失活，导致细胞内Ca2+超载。最后一种剩余机制——Ca2+螯合入线粒体导致线粒体内Ca2+超载和氧化磷酸化能力下降。细胞内超载的Ca2+诱导黄嘌呤脱氢酶向黄嘌呤氧化酶转化。后者能产生氧自由基，氧自由基氧化膜磷脂并产生丙二醛，导致膜不稳定。此外，细胞内AMP、乳酸、Ca2+、H+等代谢中间产物的蓄积可能会激活膜磷脂酶，使细胞膜降解为溶血磷脂，导致心肌细胞膜不稳定。ADP升高可诱导血小板粘附和聚集。

ADP，二磷酸腺苷；AMP，单磷酸腺苷；ATP，三磷酸腺苷；CrP，磷酸肌酸；HEPs，高能磷酸盐；LPLs，溶血磷脂；MDA，丙二醛

缺血心肌优先利用CrP所含的能量，其次为ATP、ADP、AMP，而AMP可进一步分解为腺苷和次黄嘌呤，导致细胞内腺嘌呤核苷酸池减少。此外，糖酵解产生的乳酸蓄积累在心肌细胞中，导致细胞内酸中毒。高能磷酸盐合成减少使细胞内维持钙稳态的四种机制中的三种失活，导致细胞内Ca2+超载。最后一种剩余机制——Ca2+螯合入线粒体导致线粒体内Ca2+超载和氧化磷酸化能力下降。细胞内超载的Ca2+诱导黄嘌呤脱氢酶向黄嘌呤氧化酶转化。后者能产生氧自由基，氧自由基氧化膜磷脂并产生丙二醛，导致膜不稳定。此外，细胞内AMP、乳酸、Ca2+、H+等代谢中间产物的蓄积可能会激活膜磷脂酶，使细胞膜降解为溶血磷脂，导致心肌细胞膜不稳定。ADP升高可诱导血小板粘附和聚集。

四、 外源性磷酸肌酸对心肌缺血的病理生理和药理作用

ATP在心血管疾病患者中的临床效果已在早期研究中得到评估[72-74]。静脉给药可阻断经房室结的折返环路路，恢复正常窦性心律，同时伴有较多的房室传导阻滞等不良反应。因此，阵发性室上性心动过速是ATP的主要心血管适应证[75]。而口服ATP可能导致血浆ATP水平逐渐降低，这似乎非常矛盾[76]。外源性ATP是一种带电荷的分子，含有三个不能自由通过细胞膜的负电荷[77-79]。此外，细胞膜表面有分解ATP的酶，包括ATP酶、腺苷酸激酶和AMP脱氨酶，这些酶可以将ATP分解成ADP、AMP、腺苷和无机磷酸盐[80, 81]。自从Parrat和Marshall[82]首次发表研究结果以来，CrP已被充分证明对缺血心肌具有保护作用。下面我们将重点介绍外源性CrP的病理生理和药理作用，包括但不限于补充细胞能量。

i）补充细胞内ATP

研究发现，外源性CrP的高能磷酸键可以整合到细胞内ATP分子中，提高组织ATP水平[83]。虽然在正常心脏工作情况下，外源性CrP的摄取比ATP转化率低3至4个数量级，但它可能对维持CrP或ATP池很重要（图4）[35, 83]。外源性CrP摄取率在缺血心肌低动力段可明显升高[35, 83-86]。低剂量CrP主要通过底物水平促进细胞内ATP合成。在达到一定浓度10mmol/ L时，它可以显著抑制5 '核苷酸酶和腺苷酸脱氨酶，从而维护核苷酸池水平[62, 68, 87-90]。

ii）减轻心肌细胞内Ca2+超载

正常情况下，细胞外液的Ca2+浓度是细胞内液的1万倍[91] 。此外，由于负的静息膜电位，有电荷驱动力促使Ca2+进入细胞内[91, 92]。然而，除了动作电位外，Ca2+几乎没有泄漏到心肌细胞内。甚至在动作电位期间进入细胞的Ca2+也必须从细胞中移除，否则Ca2+的蓄积将导致细胞功能障碍[92]。维持胞内到胞外浓度和电荷梯度的主要机制包括:（1）通过细胞膜上的Ca2 +- ATP酶将Ca2 +泵出细胞外[93]；（2）通过细胞膜上Na +-K+ ATP酶形成的细胞内外Na+浓度梯度进行Ca2 +与Na+的交换[94]；（3）通过肌浆网（sarcoplasmic reticulum，SR）上的Ca2+-ATP酶将细胞内的Ca2+螯合到SR内[95]；（4）将细胞内蓄积的Ca2+螯合到线粒体内封存[96]。缺血时HEPs的下降导致维持细胞钙稳态的四种机制中的三种失活。剩下的维持机制——将细胞内蓄积的Ca2+螯合到线粒体内封存，导致线粒体内Ca2+超载，最终氧化磷酸化能力下降[97]。此外，磷脂酶和蛋白激酶的激活[98]、生四烯酸的合成[99, 100]和氧自由基[101]都参与了膜完整性的破坏。这进而导致大量的Ca2+快速流入细胞。

多项研究表明，细胞内Ca2+超载是IHD心肌细胞损伤和心功能障碍的主要原因。CrP可以通过向细胞膜上依赖ATP的Ca2+-ATP酶和Na+-K+ ATP酶提供能量来减少Ca2+内流[102, 103]。同时恢复肌浆网上Ca2+-ATP酶活性，Ca2+进入肌浆网，避免心肌僵硬挛缩[104]。此外，CrP通过两性离子相互作用与膜磷脂结合，增强了膜的稳定性[105, 106]。CrP还可为肌动蛋白-肌球蛋白丝的滑动提供能量，促进心肌收缩力的迅速恢复[107]。

iii）保护心脏免受氧化应激导致的心肌损伤

缺血时，ATP水解成AMP的过程导致次黄嘌呤蓄积[108, 109]。细胞内Ca2+超载诱导黄嘌呤脱氢酶向黄嘌呤氧化酶转化[110, 111]。再灌注时，黄嘌呤氧化酶催化次黄嘌呤生成黄嘌呤和超氧化物（图4）[112]。此外，金属催化的Haber-Weiss反应可以产生更多的破坏性自由基[113-115]。上述反应产生的大量氧自由基又会氧化膜磷脂，产生丙二醛（malondialdehyde，MDA），导致膜不稳定（图4）[116]。Zucchi等[117]发现，补充外源性CrP可通过抑制心肌细胞内ADP/AMP的降解和Ca2+的蓄积，降低磷脂过氧化、MDA的产生。上述机制均可减轻心肌的过氧化损伤。

iv）稳定膜结构

维持磷脂双层膜的完整性是维持细胞整体生存能力的基本要求。ATP合成减少和酸性代谢中间产物的蓄积在缺血-再灌注损伤导致心肌细胞膜不稳定中起着关键作用，尤其是缺血的电生理表现[118]。Hajdu[119]首次报道了溶血磷脂（lysophospholipids，LPLs）可能导致心肌细胞膜不稳定。通常它们的浓度维持在很低的水平，但足够量的LPLs是强效洗涤剂，可以改变膜的一般性质，如流动性和渗透性[120]。此外，LPLs已被证明会影响细胞膜上Na+-K+ ATP酶的活性[121]。心肌缺血时细胞内蓄积的代谢中间产物，包括AMP、乳酸、Ca2+和H+等，可以激活膜磷脂酶使细胞膜降解形成LPLs（图4）。在缺血8分钟后，LPLs的水平增加了60%[121-123]。补充外源性CrP可以为细胞膜上ATP依赖的Ca2+-ATP酶酶和Na+-K+ ATP酶提供能量，减少无氧糖酵解的激活，阻断磷脂的降解过程，稳定细胞膜。此外，缺血时线粒体结构的完整性是再灌注后氧化磷酸化合成ATP的基础。CrP对线粒体膜及其氧化磷酸化功能也有保护作用[124-126]。

v）广谱抗心律失常作用

正常情况下，心肌细胞的电生理特性需要细胞膜的完整性和维持细胞内到细胞外的浓度和电荷梯度。心肌缺血后的代谢变化，包括ATP合成的减少和酸性代谢物的蓄积，导致ATP依赖性转运系统活性的降低。ATP敏感的K+通道（KATP）被正常的细胞ATP水平灭活，在缺血时打开并允许K+离开细胞[127, 128]。此外，Na+-K+ ATP酶活性降低，导致细胞外K+蓄积和快速去极化的Na+通道失活[129]。这些机制导致了心肌细胞的一系列电生理变化，包括:（1）静息膜电位和动作电位幅度明显降低;（2）去极化速度减慢;（3）动作电位时程（action potential duration，APD）缩短;（4）静膜电位到K+平衡电位的距离增大;（5）传导速度减慢[130]。有这些变化最终都会导致心律失常。

研究表明，在心肌缺血再灌注过程中，CrP可通过多种电生理机制发挥广谱抗心律失常作用，包括但不限于ATP的补充[131]。首先，外源性CrP通过向依赖ATP的KATP通道和Na+-K+ ATP酶提供能量，减少K+的胞外蓄积，重新激活快速的Na+通道，具有I类抗心律失常作用[132]。其次，外源性CrP可通过延长正常而非缺血状态下的心室心肌APD和有效不应期（effective refractory period，ERP），防止缺血区与非缺血区之间形成折返环路，发挥III类抗心律失常作用[132, 133]。第三，外源性CrP可通过减轻细胞内Ca2+超载，抑制Ca2+介导的内向电流通道激活和触发活性，发挥IV类抗心律失常作用[134, 135]。此外，外源性CrP还可通过减少致心律失常性溶血磷甘油的蓄积和增加心室颤动的阈值来发挥抗心律失常作用[136-138]。

vi）抑制血小板聚集，改善微血管功能

已知ADP不仅可以诱导血小板粘附和聚集，还可以增强胶原蛋白、凝血酶等诱导剂的聚集作用（图4）[139, 140]。当花生四烯酸途径被阻断时，ADP仍可能影响血小板[141]。外源性CrP可抑制血小板聚集，并通过快速清除ADP和形成ATP来改善微血管功能，而ATP是一种抑制ADP诱导的血小板聚集的物质[19, 142]。

五、 外源性磷酸肌酸在缺血性心脏病中的临床应用:证据与评价

如前所述，能量代谢异常是心肌缺血的上游和主要病理生理表现。而血流动力学、电生理、形态学、临床、生化和影像学改变是心肌能量代谢异常的下游和继发后果。HEPs的耗竭参与了心肌缺血的上下游变化。体外和动物实验表明，CrP可能通过多种机制（包括但不限于ATP补充）对急性和慢性心肌缺血损伤患者有益。大量的临床研究结果显示，补充外源性CrP可以改善进短期生存率[143, 144]，增强心脏收缩和舒张功能[145-147]，降低CK-MB/肌钙蛋白释放[20, 148-152]，减少心律失常的发生率[144, 151, 153-156]等。然而，除了IHD的次要终点或病理生理过程外，给予外源性CrP是否能改善长期预后仍存在不确定性。

根据Landoni等人[16]进行的荟萃分析，虽然筛选了4000多篇文章，但在IHD患者中，将CrP与安慰剂或标准治疗进行比较的研究中，只有12项符合对照或病例对照临床试验的设计要求。不幸的是，这些研究缺乏足够的统计能力获得长期生存的结果，包括:（1）单中心试验;（2）样本量小;（3）短期随访;（4）次要终点；（5）选择标准治疗而非安慰剂作为对照;（6） CrP的给药途径和剂量在各研究中存在显著差异;（7）基线信息不足或基线偏倚[20, 143, 144, 146, 150, 151, 153, 156]。此外，大多数研究发表于“血运重建时代”之前，患者是从接受非血运重建治疗或混合血运重建治疗的患者中招募的，与目前的临床实践存在显著差异[143, 144, 146, 150, 153, 156]。

乍一看，令人惊讶的是，在临床研究中，外源性CrP并没有显示出改善长期生存的作用。事实上，同样的问题也有两面性。一方面，CrP可能在心肌缺血从上游到下游的各个生理和病理生理过程中发挥广泛的作用。另一方面，CrP的心肌细胞内作用缺乏靶点和通路特异性。此外，外源性CrP在体内的摄取和分布缺乏组织和细胞特异性。这种不特异性导致IHD个体化患者外源性CrP的优势药理学机制、最佳给药途径和剂量、治疗窗口等方面存在不确定性。此外，外源性CrP的心脏保护作用可能受到内源性CrP水平的限制。然而，由于生理、病理生理和药理合理性的影响和一致性的外生CrP在多个二级的有利影响，但重要成果和短期生存，有迫切需要高质量的多中心随机对照试验（相关的）确认改善长期生存。

参考文献

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