了解MSI 错配修复基因缺失dMMR

微卫星(Microsatellite)，基因组中的一类短串联重复DNA序列，一般由1-6个核苷酸组成，呈串联重复排列。由于其核心重复单元重复次数差异，微卫星具有群体多态性。

微卫星不稳定性(Microsatellite Instability，MSI)：与正常组织相比，肿瘤中某个微卫星位点由于重复单元的插入或缺失而出现新的微卫星等位基因的现象。

MSI的发生是由于肿瘤组织的DNA错配修复出现功能性缺陷导致。伴随着DNA错配修复缺陷的MSI现象是临床上的一项重要的肿瘤标志物。

DNA错配修复(Mismatch Repair, MMR)，重要的DNA错配修复机制，能识别及修复在DNA复制或重组过程中产生的DNA错配，小范围的碱基缺失或插入，对维持基因组稳定性、遗传后代的精确性有着重要的作用。临床上常见MLH1、MSH2、MSH6、PMS2发生基因突变导致dMMR，肿瘤组织出现MSI现象是DNA错配修复缺陷(dMMR)的重要标志。

MSI的发展史

1. 发现：1993年，三个实验室同时发现了一种独特的肿瘤发生机制：研究人员在结直肠癌中寻找杂合性丢失(LOH)时，发现肿瘤组织中的某些非编码区PCR条带的片段大小相比相邻的正常组织发生了变化。在进一步的调查中，他们发现这是因为被观测到变化的DNA序列中含有微卫星位点。这种微卫星位点的片段大小改变被证实是由于DNA错配修复缺陷(dMMR)所引起的，这种现象被称之为“微卫星不稳定性”。很快，其他实验室也陆续在其他癌种中发现并研究MSI现象。

2.当时学术界对MSI并没有明确的界定标准，人们会用任何他们感兴趣的位点对肿瘤样本进行MSI检测，因此结果也比较混乱。

为了解决这一问题，第一次美国国家癌症研究所(NCI)主办的关于MSI的会议于1997年在美国马里兰州的贝塞斯达(Bethesda)举行。基于本次会议的专家共识，NCI发表了第一篇奠基性的有关MSI检测标准的论文。

首次给出了MSI的标准化定义：“与正常组织相比，肿瘤组织微卫星位点中重复单元的插入或删除导致的长度变化”。论文还推荐了一组微卫星检测Panel，包含两个单核苷酸重复位点BAT-25和BAT-26以及三个双碱基重复位点D2S123，D17S250，D5S345，共同组成5个位点的MSI检测Panel，这也就是后来为大家所熟知的Bethesda Panel(或称NCI Panel)。

3. NCI专家共识更新：随着科学家对MSI认识的深入，逐渐发现1997推荐的Bethesda Panel并非检测MSI的最优Panel。其主要原因是Bethesda Panel中的三个双碱基重复位点D2S123，D17S250，D5S345对dMMR的灵敏度和特异性均非最优。研究结果表明，单碱基重复位点是MSI检测的更优位点选择。2004年，NCI专家小组更新了MSI检测专家共识，推荐使用单核苷酸重复位点替代Bethesda panel中的双碱基重复位点D2S123，D17S250，D5S345。

全球首个商品化MSI检测试剂盒发布：2004年美国Promega公司发布了全球首个商品化MSI检测试剂盒。基于NCI专家共识，Promega公司使用了5个单核苷酸重复位点BAT-25，BAT-26，NR-21，NR-24和MONO-27检测MSI，除此之外，该试剂盒还包含两个5核苷酸重复位点(Penta C，Penta D)，用于样本内质控。Promega公司发表的文献表明，Promega Panel的性能要优于1997版的Bethesda panel。

Promega Panel 和 Bethesda panel所选用位点性能对比

 

MSI检测的临床应用

林奇综合征筛查

林奇综合征(Lynch Syndrome)是一种因胚系突变导致至少一个DNA错配修复基因(DNA mismatch repair, MMR)失活，从而引发的家族性遗传病，是一种伴常染色体显性遗传病。携带有林奇综合征缺陷的人有罹患多种癌症的高发风险，尤其是结直肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌等。据推算，约每300人中就有就有一个林奇综合征缺陷携带者，然而遗憾的是公众对此家族性遗传缺陷了解并不多。

对确诊癌症的患者进行MSI分析可以高效的筛选出疑似林奇综合征患者，是被广泛推荐的林奇综合征筛查方法之一。患者的肿瘤样本呈MSI-H表明肿瘤微卫星DNA处于不稳定状态，意味着患者肿瘤组织的DNA错配修复功能失活(dMMR)，而dMMR正是林奇综合征患者的关键特征。

MSI检测用于II期结直肠癌患者预后及治疗指导

Popat S et al.在《British Journal of Cancer》杂志上发表的一项纳入了32项研究共7642例II期结直肠癌患者的荟萃分析结果显示，与MSS患者相比，MSI-H患者死亡风险为0.65(95%CI, 0.59-0.71)，降低高达35%。目前已有大量证据表明，MSI-H是II期结直肠癌患者预后良好的一个标志物。

大量证据表明，MSI-H患者并不能从5-FU的辅助化疗中获益，MSI-H可作为5-FU辅助治疗CRC无效的预测标志物。Ribic CM et al.发表在《New England Journal of Medicine》杂志上的文献数据显示：在II期结直肠癌患者中，MSI-H患者接受辅助化疗较未经治疗者并无生存优势，5年生存率反而显著缩短(71% vs. 88%)。这表明：对于MSI-H的II期患者，给予5-FU辅助化疗非但不能带来生存获益，反而对患者不利。因此，II期CRC患者是否需要辅助化疗，需要综合考虑临床高危因素和MSI状态。

《中国结直肠癌诊疗规范2015》建议有条件者检测组织标本MMR或MSI(微卫星不稳定性)，如为dMMR(错配修复缺陷)或MSI-H(微卫星不稳定)，不推荐氟尿嘧啶类药物的单独辅助化疗。

MSI作为PD-1药物治疗实体瘤的生物标志物

2015年，一篇发表在《新英格兰杂志》标题为《PD-1 Blockade in Tumors with Mismatch-Repair Deficiency》的文章重新引爆了公众对MSI的兴趣。Dr. Le和他的同事们拓展了MSI在肿瘤免疫治疗中的应用，证实了MSI状态与免疫治疗异常烈的反应相关。

在Dr. Le和他的同事们主持的一项关于PD-1免疫检查点阻断剂在结直肠癌中的作用研究中，33个样本只有1个有应答。经调查，作者发现这位患者的肿瘤是MSI-H分型。他们的进一步研究发现，具有MSI-H分型的肿瘤具有针对新抗原的高免疫细胞浸润，但被免疫检查点抑制配体(如PD-L1)所抵消，PD-L1结合PD-1阻止了T细胞活化。当使用PD-1免疫检查点阻断剂时，免疫细胞可以激活并攻击肿瘤细胞。基于此，即便是单剂量的治疗，患者的血清也能马上反映出临床受益。在Dr. Le所发表的论文中，其MSI检测使用了Promega公司提供的MSI检测试剂盒“MSI Analysis System”。

MSI检测Panel选择

由于微卫星位点的不稳定阳性率各不相同，比如BAT-25和 BAT-26这两个位点的阳性率比较高，NR-24的阳性率则稍低于前两者，而D2S123这类双核苷酸重复位点则明显低于BAT-25这类单核苷酸重复位点。因此不同MSI分析Panel选取的不同微卫星位点，将直接影响到MSI的诊断结果。

另外，选取的微卫星数量也是一个影响因素，若纳入了一些阳性率较低的微卫星位点，则会在一定程度上降低MSI检测的灵敏度，因此并不是位点越多越好。Bethesda Panel和Promega的位点选择已有较多研究数据支持，且得到了NCCN指南的推荐。如果检测位点未经过大规模研究数据验证，则可能会造成假阴性或假阳性的结果。

2020年NCCN发布了《Genetic/Familial High-Risk Assessment: Colorectal，Version1 .2020-July 21, 2020》(《结直肠癌家族性遗传高危评估指南，2020年第1版》)，关于MSI检测，NCCN推荐了两种MSI分析Panel：

Promega Panel：

包含5个单核苷酸位点(BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24, MONO-27)以及2个用于样本匹配鉴定的五核苷酸位点。由美国Promega公司于2004年发布，并基于此推出MSI Analysis System商品化试剂盒。

Bethesda Panel：

包含2个单核苷酸位点(BAT-25, BAT-26)和3个双核苷酸位点(D2S123, D5S346, D17S250)。Bethesda/NCI Panel是美国国家癌症研究所(NCI)于1997所推荐的标准，并以此命名。2004年，NCI专家小组更新了MSI检测专家共识，推荐使用单核苷酸重复位点替代Bethesda panel中的双碱基重复位点D2S123，D17S250，D5S345。

 

通过以上了解 我们大概对微卫星不稳定性的前因后果有了大致了解，那么我们在临床中的应用。

尤其在肿瘤临床中的应用。

微卫星不稳定性是指在肿瘤组织中某一微卫星由于重复单位的插入或缺失而造成微卫星长度的改变，出现新的微卫星等位基因现象。

发生机制主要包括DNA多聚酶滑动导致重复序列中一个或多个碱基的错配和微卫星重组，导致碱基对缺失或插入。错配修复指在含有错配碱基的DNA分子中，使核苷酸序列恢复正常的修复方式。错配修复基因家族包含九个基因，用来纠正DNA双螺旋上错配的碱基对，修复因复制而产生的小片段核苷酸插入或缺失错配。错配修复的过程是错配修复基因识别出正确的DNA链，切除不正确的片段，通过DNA聚合酶和DNA连接酶的作用合成正确配对的双链DNA。结直肠癌患者常发生错配修复基因缺失，错配修复基因突变或启动子甲基化。

MSH2和MLH1基因突变占错配基因改变的90%以上。错配修复基因突变或启动子甲基化导致错配修复基因功能缺失引起含有错配碱基核苷酸插入或错配缺失的DNA分子不能正常修复，引起广泛的MSI，即微卫星不稳定性。

因此微卫星不稳定性检查是预后好能否用免疫治疗的一个重要指标。